病毒载体是一种常用的分子生物学工具，病毒能够携带基因进入受体细胞，经开发和改造后能够作为基因治疗的载体。但和传统生物药一样，病毒载体类产品在生产过程中也可能会受到内源与外源病毒的污染。针对此类产品，相关法规也在不断完善以加强病毒安全性控制。在升版后的ICH Q5A(R2)中增加了适用产品的范围，其中就包含了“能够开展病毒清除但不会对产品产生负面影响的特定基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品”。
应用于传统生物制品病毒安全性控制的三项基本原则——选择、检测、去除，同样适用于病毒载体类产品。但病毒载体类产品生产过程中使用的一些病毒清除步骤可能无法达到与传统蛋白类生物制品相同的效果，在这种情况下，应该考虑实施进一步降低风险的策略。在本篇中将和大家详细探讨如何进行病毒载体类产品的病毒清除验证。
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病毒载体类病毒清除验证研究应包括生产病毒本身或特异模式病毒以及能够代表外源和内源病毒的模式病毒。比如对于杆状病毒生产系统，可以将杆状病毒作为病毒清除验证的模式病毒之一；如果在生产中使用了5型腺病毒（Ad5）、单纯疱疹病毒（HSV）等辅助病毒，也需要在病毒清除验证研究时将这些辅助病毒作为模式病毒进行病毒清除验证研究；对于昆虫细胞系，比如Sf9细胞系，可以使用昆虫弹状病毒作为模式病毒进行病毒清除验证研究，水疱性口炎病毒（VSV）也常常作为昆虫弹状病毒的特异模式病毒对下游病毒清除能力进行评价。基于内源与外源病毒的风险，必要时需要使用其它模式病毒进行病毒清除验证研究。以下列举了一些可以用于病毒载体类产品病毒清除验证的模式病毒。
表一：能够用于病毒载体类产品病毒清除验证的模式病毒举例[1]
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病毒灭活
通常，在下游生产过程中会包含至少两种不同机制的病毒清除工艺步骤，即灭活和去除。常见的灭活步骤有低pH和溶剂/去污剂（S/D）法。不同病毒的理化抗性不同会导致低pH灭活效果的不同，其它因素，如pH值、缓冲液种类、处理时间、处理温度等，都会影响低pH法对于有包膜病毒灭活效果。对于S/D法，也需要重点关注使用的溶剂/去污剂种类、处理时间、处理温度等因素。
如生产中使用腺病毒作为辅助病毒，工艺中通常也会包含50°C以上的加热灭活步骤，如图一时间及温度对于5型腺病毒（Ad5）灭活动力学的影响所示，50°C以上的加热灭活步骤能够确保辅助病毒被充分灭活。另外通过相关研究表明[2]，50°C以上的加热灭活步骤对Ad5有不错的灭活效果，通常能达到6或者更高的LRV值。
图一：时间及温度对于5型腺病毒（Ad5）灭活动力学的影响[3]
病毒去除
对于病毒去除，常见的工艺步骤有层析和病毒过滤。层析包含亲和层析、阴离子层析、阳离子层析、疏水层析等。亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力将产品和病毒进行分离，研究表明[1]，亲和层析对于HEK293表达系统的重组腺相关病毒（rAAV）产品的多种模式病毒都有一定的去除效果。离子交换层析去除病毒的能力主要是以静电作用为主导作用，对于病毒载体类产品的内源及外源病毒清除效果较好。表二展示了不同层析步骤对于病毒载体类产品中模式病毒的病毒清除效果。
表二：对于不同模式病毒层析步骤所取得的病毒滴度对数下降值（LRV）[1]
x: 不适用
病毒过滤利用病毒和产品分子大小不同，通过将病毒截留达到病毒去除的效果。病毒过滤是可靠、稳健的病毒去除工艺，但对于不同病毒载体产品需要选择不同孔径的除病毒过滤器。对于腺病毒和慢病毒载体，需要选择较大孔径的滤器，如30nm甚至更大孔径除病毒过滤器。有研究向AAV产品中分别掺入一定量MuLV和PRV使病毒初始浓度达到5.0x106TCID50/ml，并使用0.45μm过滤器去除聚集体；使用50ml掺入病毒的AAV产品进行病毒过滤验证实验，在载量为27L/m2和115L/m2时收集滤液，并使用10ml缓冲液对滤器进行冲洗。实验结果表明，病毒过滤对于AAV产品中MuLV模式病毒的去除效果良好，并且LRV大于6，对于PRV的去除效果也能达到不小于5.4LRV，同时对于产品的回收率能达到90%。[4]
03
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在ICH Q5A升版后，今年1月，国家药监局也发布了《重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则》，对于重组腺相关病毒载体类产品在申报临床实验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。
本篇法规对于重组腺相关病毒载体类产品病毒清除验证提出了具体要求：“针对设立的病毒清除/灭活工艺单元，建议参考ICH Q5A的一般原则开展病毒清除/灭活验证研究。如有可能，验证研究应尽可能将原材料或工艺步骤中可能引入的病毒或同类病毒纳入指示病毒，如昆虫细胞/杆状病毒包装系统中的杆状病毒和潜在的弹状病毒等。有效的病毒清除/灭活工艺单元病毒滴度下降因子应能达到≥4log10的病毒清除/灭活效果。”
今年5月，国家药监局也发布了关于适用ICH Q5A(R2)指导原则的公告，要求“自2025年5月21日开始的相关研究（以试验记录时间点为准），均适用于Q5A(R2)指导原则。”ICH Q5A(R2)将病毒载体类产品加入其适用范围，因此国内对于病毒载体类产品病毒清除验证的要求也在不断规范和明确，下表给出对处于不同阶段的产品进行病毒清除验证相关研究的关键考量点以供大家参考：
表三：对处于不同阶段的产品进行病毒清除验证相关研究的关键考量点
赛多利斯的Confidence®病毒清除服务验证团队拥有专业而多方面的人才团队，对法规深入理解和前沿解读，以及对病毒清除工艺深入理解和病毒清除技术的专业知识，可以为客户提供满足申报及工艺探索的病毒清除验证研究、耗材和技术服务的一站式解决方案。
往期回顾
实施建议解读 | ICH Q5A(R2):
来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价
实施建议解读 | 治疗用重组蛋白产品
临床试验申请病毒清除工艺平台验证技术指导原则（试行）
聚焦产品 | 疫苗产品病毒清除验证关键考量点
参考文献
[1] W. Wang et al., Current approaches and considerations for viral clearance in cell and gene therapy, Jun. 2023. doi: 10.46220/2023cgt004.
[2] Barbara A. Thorne, Paulene Quigley, Gina Nichols, Christine Moore, Eric Pastor, David Price, Jon W. Ament, Ryan K. Takeya, Richard W. Peluso. s.l. Characterizing clearance of helper adenovirus by a clinical rAAV1 manufacturing process. Biologicals 36 (2008) 7-18.
[3] Maheshwari G., Jannat R., McCormick L. and Hsu D. s.l. Thermal inactivation of adenovirus type 5. Journal of Virological Methods, Volume 118, Issue 2, 15 June 2004, pp.141–-146.
[4] Yuyu Long, Albert S. Reger, Eric R. Weiss, Surya Addepalli, Thomas Parker, Corinne E. Miller, John O’Grady, David R. Knop. Optimization, Validation and Implementation of Retroviral Retentive Filters for Production of Adeno-Associated Virus (AAV); Application Note. MilliporeSigma.
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