灌流工艺是一种连续的细胞培养方法。相较于传统的批次培养模式,灌流培养可以实现更高的细胞培养密度、持续的营养供应以及实时的代谢废物去除。这使得灌流培养工艺成为提升单抗产量和降低生产成本的关键。
优化单抗灌流工艺的关键参数是提升生产效率和产品质量的重要措施。通过合理的参数调整,可以显著提高细胞的生长能力和抗体的产量。（双抗灌流工艺优化参见文章：双抗灌流工艺新探索：小型玻璃反应器在高效生产中的深度应用。）
本文研究了在Biostat® B上通过优化连续灌流培养工艺中补料培养基比例、灌流速率以及温度控制等参数对细胞生长、抗体表达等方面的影响，为单抗生产提供理论支持和实践指导。
实验设计与方法
本研究使用CHO K1细胞生产PD-1抗体进行连续灌流工艺优化的探索。将冻存的细胞复苏后在摇瓶中扩增培养，然后接种到Biostat® B 2L罐体的生物反应器中。Biostat® B已经与ATF2（0.13m2）连接，组成自动灌流装置, 装置连接情况如图1所示。
图1 Biostat® B 2L 罐连接ATF 进行连续灌流培养
细胞以初始密度0.5x106 cells/mL接种到Biostat® B反应器中，培养体积为1L。该研究设计培养周期为20天，初始培养基为Smart CHO-PM Medium。反应器培养参数设置详见表1。
表1 Biostat® B 2L连续灌流培养操作参数
在灌流培养过程中,灌流培养基的选择对细胞生长、抗体表达有非常重要的影响。本研究中所用灌流培养基为混合培养基，由Smart CHO PM Medium（基础培养基）和Smart CHO Feed Medium（补料培养基）混合配制。基于项目前期的数据,本研究中将补料培养基的比例由8%优化为6%, 在保障细胞生长所需营养成分的同时减少补料培养基用量,降低培养基成本。
灌流培养基用量会影响每天滤出收获液体积，进而影响下游工艺的处理量、抗体浓度以及工艺成本等。而灌流速率是影响灌流培养基用量的关键参数。细胞特异性灌流速率（CSPR）是指单位时间内每个细胞灌流到的新鲜培养基体积，降低CSPR有助于降低培养基消耗。在本研究中,细胞灌流培养最初的灌流速率为0.5 VVD,随着细胞密度升高,逐步调节至2.5VVD，CSPR后期控制在35pL/cell/day。
在细胞培养过程中，通过降温操作调控细胞增长速率, 同时根据细胞生长趋势分析，调控细胞放流速率（Bleeding Rate），控制细胞密度相对稳定在70x106 cells/mL水平，以提高细胞产能。
实验结果与讨论
本次连续灌流培养参数优化的研究结果与项目前期在Ambr® 250 HT生物反应器上的结果进行了比对，结果显示工艺优化后在抗体滴度、细胞密度等方面都得到了一定的提升，细胞活率基本稳定在90%及以上，结果如下：
细胞生长方面
如图2（a）所示，在培养初期，细胞增殖正常。在Day3细胞密度达到初期设定值开始灌流后，细胞密度升高明显。在Day6-day8进行降温操作后，有效控制了细胞生长速率。从Day9 开始细胞渗出（bleeding）操作，调控细胞密度维持在70×106cells/mL水平。在图2（b,c）中，细胞活率保持在90%及以上，且每天滤出收获液中抗体滴度平均在0.8g/L以上，进行稳定的连续灌流培养。
对比图中Biostat® B 和 Ambr® 250HT的数据，优化后整体工艺表现符合预期，细胞密度和活率以及抗体滴度均满足工艺要求。此外该研究也再次验证了Ambr® 250HT的工艺可以顺利放大到B罐。
图2 Biostat® B罐与Ambr® 250HT中细胞密度
（a）、细胞活率（b）、抗体滴度（c）的结果对比
细胞代谢方面
图3显示在Biostat® B 罐的培养过程中，葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺代谢趋势与Ambr® 250HT可比, 说明在降低补料培养基比例和细胞特异性灌流速率后，可提升代谢水平，符合工艺预期。
图3 连续灌流培养过程中细胞代谢指标变化趋势图
抗体表达方面
与传统的批次补料培养工艺（历史数据）相比, 培养体系的时空产率（g/L/day）提高3.6倍，细胞比生产率（Qp）提高1.4倍，整体抗体产量提升3倍以上，说明灌流培养工艺比批次补料培养工艺有更高的生产效率和细胞产能，具体对比数据如表2。
表2 连续灌流培养与批次补料培养的抗体产能对比数据
总结
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在该研究中，我们使用Biostat® B 2L生物反应器连接ATF组装成自动灌流培养装置。通过降低补料培养基的比例、降低CSPR、降低高细胞密度下的培养温度等参数, 实现了调控细胞密度在(50-70) x106 cells/mL状态下连续灌流培养超过10天, 细胞活率在90%及以上, 每天滤出收获液中抗体平均滴度大于0.8g/L，CSPR为45-35 pL/cell/day。
在该系列研究中, Ambr® 250HT 和Biostat® B罐作为生物反应器中的两把”利器”,有效地加快了灌流工艺开发的速度，不仅体现在高效筛选工艺条件、优化工艺参数，而且也体现了两个罐体间工艺放大的稳定性。
参考文献
Zhang Q, Fang M, Li J, Cao R. [Development and optimization of perfusion process for mammalian cell culture]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2020 Jun 25;36(6):1041-1050. Chinese.
Wong, H.E., Chen, C., Le, H. and Goudar, C.T. (2022), From chemostats to high-density perfusion: the progression of continuous mammalian cell cultivation. J Chem Technol Biotechnol, 97: 2297-2304.
