引 言
随着细胞治疗的快速发展，慢病毒载体作为一种有效的细胞基因修饰工具被广泛应用，尤其是在CAR-T细胞治疗中。慢病毒是逆转录病毒的一种，来源于改造的人免疫缺陷病毒，具有外源基因装载容量大、可稳定表达以及免疫原性低等优势。目前常用的第三代慢病毒载体，已经剔除了复制相关基因和毒性基因，在应用上获得了更高的安全性。但是，由于慢病毒载体颗粒大、有包膜等特点，使其生产工艺具有较大挑战，工艺用时长、整体收率低。
本文将介绍在各种“膜”力组合下，一种更高效的慢病毒下游工艺平台解决方案，以提高整体收率。
实验方案
慢病毒载体的生产常用HEK293细胞进行制备，培养方式有贴壁培养和悬浮培养，培养获得的料液在经过核酸酶消化处理后，用于后续工艺测试。在与丽山生物工艺合作项目中，我们同时优化对比了贴壁和悬浮体系收获的慢病毒料液在下游纯化过程中的结果。具体实验方案如下图所示：
图1 实验方案流程示意图
实验材料与方法
实验结果与分析
收获/澄清
上游工艺收获的慢病毒料液经过核酸酶的消化后，进入下游工艺流程，第一步便是澄清。贴壁培养的料液为细胞培养上清，含有少量的细胞或细胞碎片，料液浊度相对较低。此次收获料液的初始浊度为26NTU。
滤器测试结果分别从滤后浊度、收率和载量三个方面进行分析，结果如图2所示。不同滤器澄清料液的收率均在90%以上，孔径越小，收率越高。Sartopure PP3 0.45μm 滤器对料液浊度的处理效果最佳，滤后料液浊度小于10NTU，更有利于后续工艺的进一步处理。从载量上来看，玻纤材质的滤器载量最高，其次是聚丙烯材质的滤器。综合比较可以看出，对于贴壁料液或浊度较低的料液，可以通过Sartopure PP3 0.45μm滤器进行一步澄清，既保障了澄清工艺的收率和载量，同时料液的降浊效果也可满足工艺要求。
图2 不同滤器澄清后料液浊度、收率、载量的比较结果
此外，悬浮培养的收获料液，因含有大量的悬浮细胞或细胞碎片使得料液浊度较高，通常可达数百NTU。对于此类料液，通常有两种处理方案，一种是离心+澄清过滤（如离心+Sartopure PP3 0.45μm），另一种是多种不同孔径的滤器组合进行多级过滤（如Sartopure PP3 8μm +Sartopure PP3 0.45μm）。通常在料液体积较小时选择第一种方案，操作便捷高效；当料液体积增大后，考虑到大型离心机的成本投入以及一次性工艺的可扩展性，更多的会选择多级滤器组合使用。
超滤
澄清后的病毒料液中含有核酸酶、宿主细胞蛋白等杂质，通过超滤浓缩换液可以在减少料液体积的同时，去除部分小分子量杂质并置换为层析缓冲液，为后续层析纯化工艺做准备。此外超滤也可以应用在层析工艺后，及时置换病毒料液的缓冲液，提高病毒稳定性。
在慢病毒超滤工艺中常用的耗材有中空纤维和膜包两种，丽山生物超滤设备为赛多利斯SARTOFLOW smart超滤系统。我们通过优化剪切力、切向流速、跨膜压等参数，分别测试了Hollow Fiber 750KD、膜包Hydrosart 300KD（宽流道E/窄流道ECO）处理来自悬浮培养、贴壁培养的澄清料液的情况，为更大规模料液的超滤工艺提供参考。
结果如图3所示，在超滤处理贴壁培养或悬浮培养的澄清料液时，Hollow Fiber750KD收率最高（>80%），其次是膜包Hydrosart 300KD (ECO)；而膜包的通量优于Hollow Fiber。因此在超滤工艺上考虑耗材的选择时，需要综合评估料液体积、工艺时长、工艺成本等因素，以判断在保障收率时，通过增加中空纤维柱面积来缩短工艺耗时的可行性。
图3 中空纤维和膜包处理多批慢病毒料液的数据对比
除菌
慢病毒颗粒直径约100nm, 达到除菌滤器孔径0.2μm的一半。若料液存在病毒聚集体或杂质残留较多，会导致病毒被拦截或吸附在滤膜上降低工艺收率。有研究文章报道，慢病毒料液除菌工艺的收率做到了80%以上，然而在实际操作中挑战很大。
基于前期数据积累，在本项目中，我们重点使用Sartopore 2滤器进行除菌工艺优化。该滤器是聚醚砜材质的双层孔径膜（0.45μm+0.2μm），相比于单层膜可以提高过滤载量。在A、B、C多组实验中，A组、B-1组和B-2组料液来自贴壁培养，分别在压力终点0.75bar、1.0bar以及2bar的条件下，收率均在63%以上，最高收率为72.3%，载量可接近100L/m2。C组料液来自悬浮培养，工艺收率虽略低于A/B组实验，但仍保持在50%以上，载量大于60L/m2。由此可见，慢病毒上游工艺和下游前处理工艺对最终除菌工艺的收率有明显影响，稳健的工艺可以有效提高慢病毒感染滴度收率。
图4 滤器Sartopore 2在除菌工艺的优化结果
总 结
在该项目中，通过将澄清滤器“膜”、超滤耗材“膜”（中空纤维柱或膜包）以及除菌滤器“膜”的接力应用，我们测试并优化了膜分离技术在慢病毒下游工艺的应用。在贴壁培养收获液的下游工艺中，这三步工艺的综合收率已超过60%！这不仅有效提高了慢病毒下游工艺整体收率，也为悬浮培养收获液的下游工艺优化提供了参考。
致谢
本项目由丽山生物（山东丽山生物科技有限公司是一家细胞与基因治疗的CDMO公司，主要业务涵盖质粒、病毒、细胞等科研技术服务和工业化生产。）慢病毒工艺开发团队与赛多利斯工艺开发团队共同合作完成，感谢丽山生物慢病毒工艺开发团队的大力支持。
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