引 言
前面我们介绍了单抗的灌流工艺，通过灌流工艺，抗体产量获得了极大的提高。对于动态或连续灌流而言，产量高、收获总体积大。相应地，下游如何与上游灌流进行有效衔接、进行高效、高质量纯化，成了现今研究的热点。
本文研究了膜层析和膜分离技术在单抗灌流培养条件下的纯化应用，建立了亲和、阴离子交换、疏水膜层析单抗纯化工艺。同时结合低pH灭活、除病毒过滤、超滤工艺开发，将各工艺条件进行有序衔接。建立了高效、高质量的单抗下游“膜纯化”平台
实验设计与方法
整个下游工艺依次为：Sartobind®Rapid A亲和膜层析、低PH灭活、Sartobind®Q阴离子交换膜层析、Sartobind®phenyl疏水膜层析、Virosart®HF 除病毒过滤、Hydrosart 切向流过滤以及sartopore 2 除菌过滤。具体方案如下
Sartobind®Rapid A亲和层析
采用10ml Sartobind®Rapid A亲和膜层析进行抗体粗纯捕获，具体方案参数见表1：
表1 Sartobind®Rapid A亲和层析方案参数表
低pH灭活
经过抗体低pH条件下的稳定性研究，灭活条件设定为：pH3.6 ，灭活时间1h。
Sartobind®Q 阴离子交换层析
该步采用流穿模式，用10ml Sartobind®Q去除大部分HCP、HCD等杂质。经过前期载量测试和纯化条件摸索，该步工艺参数见表2：
表2 Sartobind®Q 阴离子交换层析方案参数表
Sartobind®phenyl 疏水层析
该步采用流穿模式，拟进一步去除HCP、HCD、聚合物等杂质。经过前期载量测试和纯化条件摸索，该步工艺参数如下：
表4 Sartobind®phenyl 疏水层析方案参数表
Virosart® HF 除病毒过滤
以Virosart®HF为除病毒滤器（Virosart ®Max 作为预过滤器），在2Bar压力下对抗体进行恒压过滤在恒压2bar下进行除病毒过滤。
超滤浓缩
用Hydrosart® 30KD超滤膜包对除病毒后的单抗进行超滤浓缩。经过TMP优化，操作参数如下：
Sartopore 2 除菌过滤
用sartopore2 0.2um滤器在0.5bar压力下对抗体进行恒压过滤。
各工序链接设计
本研究中，分别选取收获液、亲和洗脱样品、低pH灭活过滤后样品分别在26℃、4℃条件下放置3-10天。通过检测SEC-HPLC和CEX-HPLC检测其稳定性。依据各步骤蛋白稳定性及各工艺处理效率来决定料液合并频次以及各步纯化处理频次
实验结果与讨论
01
Sartobind®Rapid A亲和层析结果
层析图谱（叠加处理后）
图1-1 不同亚批层析图谱
图1-2 某一亚批13次循环图谱
从Rapid A 亲和层析图谱1-1可以看出，针对不同下罐时间的收获液，上样量略有不同，但洗脱曲线趋于一致。图1-2可知，在相同料液，相同载量下，层析曲线完全一致，体现了Rapid A 在多次重复循环模式下的高度重复性。
质量及收率指标
从质量指标来看，经过Rapid A 捕获后，SEC-HPLC纯度约99%左右，HCP和HCD在可控范围内。R Protein A 杂质含量在药典限定范围内。各项指标均满足工艺要求。为后续层析提供了便利条件。
02
Sartobind®Q 层析结果
Sartobind®Q 层析图谱
图2 Sartobind®Q层析图谱
Sartobind®Q 质量及收率指标
综合Q膜层析图谱和质量及收率指标可得：Q膜在900g/L的载量下，仍有较强的HCP、HCD去除能力，该载量远高于传统填料100~200g/L的载量,且该载量仍有较大安全余量. 同时在10MV/min流速下，膜层析能处理600CV/h。其处理效率亦要远优于传统填料。
03
Sartobind® phenyl层析结果
层析图谱
图3 Sartobind®phenyl层析图谱
质量指标
综合Sartobind® phenyl膜层析图谱和质量及收率指标可得：phenyl膜在流穿模式下，载量可达300g/L，作为第二步精纯，有一定的HCP、HCD去除能力，且有一定的聚合物去除能力（因本案例中，Q纯化后SEC-HPLC纯度已经很高，故本次研究未能充分体现）,收率亦较高。
进一步分析得：经过三步膜层析后，抗体纯度、杂质含量指标完全满足药典及工艺要求。膜层析在单抗中有着很好的工艺应用。
04
Virosart Max+Virosart HF除病毒过滤
过滤曲线如下（抗体浓度1.5mg/ml）：
图4 除病毒过滤曲线图
由图可得：整个过滤过程中，流速衰减缓慢，后期流速保持稳定，过滤结束时载量2653L/m2，此载量仍有较大安全余量。完全满足工艺要求。
05
Hydrosart 30KD 超滤浓缩
超滤流速和收率结果如下：
从上表可以看出：样品在308g/m2载量下，流速满足工艺要求，水通量恢复率高达100%。为膜包多次重复使用提供了理论依据。
06
稳定性考察及工序衔接
稳定性考察结果表明：收获液和亲和洗脱样品在26℃ 3天内均维持稳定。深层过滤后样品在4℃下5天内维持稳定。因此在该料液模型下，收获液室温下理论可三天合并一次做亲和捕获。亲和洗脱样品也可放置三天，深层过滤及后续层析样品理论可在10天内合并处理依据稳定性考察结果。实际工艺设计如下
表六 下游各步骤衔接时间计划示意图
上图设计中，上游Day1开始有灌流收获液,直至Day11灌流结束，收获液终止收集。因收获液3天内质量稳定，因此可在第三天（Day3）将Day1~day3的收获液合并后统一进行Sartobind®Rapid A 处理。同时亲和处理后结合洗脱液实际情况当天进行低pH灭活。以此类推至Day6、Day9、Day11进行相同的亲和捕获操作. 因低pH中和后样品在10天内4℃稳定，故可将前述亲和/低pH灭活后样品统一进行Sartobind Q和Sartobind phenyl（HIC）处理。同时因为Sartobind Q和Sartobind phenyl载量大，流速快。故可在一天内全部完成。全部层析结束后可在纯化最后一天(Day13)进行除病毒过滤以及超滤浓缩。该纯化计划安排大大提高了灌流收获液下游的生产效率，同时仍有一定的灵活调整空间。
小 结
本研究通过创新型膜层析技术与膜分离技术的开发应用，建立了灌流培养条件下单抗下游纯化整体工艺平台。该工艺平台单抗纯化效率高，层析流速达5~10CV/min。且SEC-HPLC纯度>99%、HCP、HCD、残留protein A等杂质含量符合原液要求
针对单抗灌流培养连续收获的特性。在工艺开发基础上，结合料液稳定性及膜层析高流速、高载量、便于快速多次使用特点，本研究同时设计了符合实际生产工况下的各工序衔接和时间计划安排。该设计充分发挥了膜纯化的效率优势，大大提高了灌流条件下的纯化效率，为单抗下游中试及商业化生产工艺提供了参考借鉴.
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