人类端粒是位于染色体末端的富含G的六聚体重复序列（TTAGGG）。端粒的稳定是各种细胞过程（包括细胞衰老、染色体复制和肿瘤进展）的基础。在正常体细胞中，端粒的长度在细胞分裂的每个周期中都会减少，这种逐渐缩短的过程是控制细胞寿命的主要计时机制。与此相反，在大多数肿瘤细胞系中，端粒的长度可以通过激活端粒酶来维持。端粒酶是一种反转录酶，能够在染色体末端添加端粒重复序列。它在各种癌细胞中过度表达，被认为是肿瘤的明显标志。人类端粒酶的催化核心由催化蛋白亚基和模板RNA（人类端粒酶RNA，hTR）组成。由于hTR是端粒酶延长端粒所必需的，因此它的表达被用来揭示端粒酶的活性。然而，一些研究表明，hTR的表达与端粒酶活性并不成正比。因此，设计检测工具以精确定位hTR的位置和端粒酶活性、了解端粒酶相关病理和癌症中端粒酶的激活具有重要意义。到目前为止，已经开发出了众多具有逻辑门设计和不同载体的探针，以实现端粒酶在细胞中的生理活性。然而，对hTR的检测仍然很少见，也无法在肿瘤细胞中实现实时检测。因此，开发一种活细胞中hTR和端粒酶活性的原位亚细胞共成像策略仍是当务之急。近期，华东理工大学钱若灿副教授与南京大学鞠熀先教授合作，报道了一种用于精确分析端粒酶模板RNA与酶活性的模块化DNA纳米器件，相关成果以A modular engineered DNA nanodevice for precise profiling of telomerase RNA location and activity 为题发表在Advanced Science。DNA-ND包含两个模块部分，由一条底物链和三条功能链杂交组成。第1部分是hTR检测模块，底物链（Strand-S）的3'-end部分与hTR靶向配体链（hTR-L）杂交。hTR-L的3'-端被设计为用于识别hTR的粘性末端。hTR-L的5'-端用荧光团Alexa Fluor488（AF488）标记，BHQ1通过荧光共振能量转移（FRET）将其淬灭。在hTR存在的情况下，hTR-L的粘性末端与hTR结合，诱导FRET对的解离，从而“打开”与hTR相对应的荧光信号（AF488）。第2部分是端粒酶活性检测模块，它包含两条与Strand-S杂交的功能链：一条端粒酶引物链（TP）和一条端粒酶激活信号链（TA-S）。TA-S的3'端被Cy5标记，而Strand-S的5'端被BHQ3标记淬灭。TP序列可在3'-端伸长，产生与TA-S杂交部分互补的端粒重复序列，从而导致置换杂交以去除TA-S。由于Cy5远离BHQ3，这一过程会打开Cy5的荧光，从而点亮激活的端粒酶。将DNA-ND封装在脂质体中后，在脂质体表面连接一个典型的核定位序列（DNA-ND-Lipon），将DNA-ND送入细胞核。未修饰的脂质体用于将DNA-ND送入细胞质（DNA-ND-Lipo）。与DNA-ND-Lipo/DNA-ND-Lipon孵育后，DNA-ND可实现亚细胞转运，从而实现hTR亚细胞定位和端粒酶在活细胞中的活性。用于精确分析端粒酶RNA位置和活性的模块化DNA纳米器件的示意图丨来源：Advanced Science
根据之前的报告，不同细胞系的hTR表达水平和端粒酶活性各不相同。在三种不同细胞系（HeLa细胞、MCF-7细胞和LO2正常细胞）中评估了DNA-ND的性能。hTR和端粒酶活性的总体荧光强度可区分为：HeLa＞MCF-7＞LO2。相应的荧光直方图和流式细胞分析证实了这些结果。此外，散点图显示了hTR与端粒酶活性的荧光分布，从中可以很好地区分不同的细胞。具体来说，hTR倾向于反映转录后成熟端粒酶复合物的水平，因此hTR可用于指示端粒酶数量含量的上限，而不是端粒酶活性的指标。接下来，进一步研究了hTR和端粒酶活性在HeLa细胞、MCF-7细胞和LO2正常细胞核区的分布。从显示核区的共聚焦细胞图像中可以看出，在HeLa细胞核中，hTR的荧光强度最高，而在LO2正常细胞核中观察到的荧光可忽略不计。端粒酶活性的荧光也表现出类似的趋势。这些数据表明，只有一小部分端粒酶蛋白-hTR嵌合体位于正常细胞的细胞核中，但在癌细胞中这一比例会升高。此外，细胞核中hTR与端粒酶活性荧光分布的散点图可以有效区分不同的细胞。所有这些结果都验证了DNA-ND作为成像纳米传感器实现hTR和端粒酶活性原位正交共成像的可行性。为了解释在不同细胞中观察到的亚细胞荧光分布，采用了基于MATLAB的逻辑运算，通过MATLAB代码分析单通道荧光图像，定量说明hTR和端粒酶活性的共定位情况。根据荧光强度，提取共聚焦荧光图像上的每个像素，以确定荧光信号的存在（定义为1）或不存在（定义为0）。然后，将这些二进制值转换成两个矩阵，分别对应绿色（AF488）和红色（Cy5）荧光通道。通过逻辑“XOR”操作，生成灰度图像。这种基于像素的转换大大提高了细胞图像中非定位区域的可见度和清晰度。同样，逻辑“AND”操作也用于增强同时出现绿色和红色荧光的共定位区域。通过构建“XOR”和“AND”逻辑灰度图像，可以直观地区分hTR和端粒酶活性的非共定位区域和共定位区域，并对每个通道对应的区域进行量化，以显示hTR和端粒酶活性的亚细胞分布图。此外，还可以利用共定位像素计算不同亚细胞区域的共定位区域面积比。基于这些逻辑运算，不同细胞系中的荧光分布可以清晰区分，可以将有荧光信号的细胞区域划分为四个不同的部分。从结果可以看出，HeLa细胞的共定位面积明显高于MCF-7细胞，细胞质内的共定位比例是MCF-7细胞的1.5倍。MCF-7细胞核内的共定位比例明显低于HeLa细胞，这表明端粒酶蛋白与hTR的结合率较低。此外，不同癌细胞（HeLa细胞和MCF-7细胞）的共定位散点图也很容易区分这两者。结果证明，逻辑处理可以区分hTR和端粒酶活性在亚细胞表达比例上的细微差别，有助于了解肿瘤细胞增殖差异背后的潜在因素。利用基于DNA-ND的双重成像方案，继续探索药物处理后HeLa细胞中hTR和端粒酶活性的协同表达。首先测试了非核苷化合物BIBR1532，这是一种是TERT的特异性抑制剂。BIBR1532可通过与端粒酶核心的非催化位点结合来抑制端粒酶的催化活性。HeLa细胞在BIBR1532处理前后的荧光共聚焦图像显示，处理后细胞核和细胞质中Cy5的荧光面积均有所减少，表明端粒酶活性下降。hTR的荧光强度几乎没有变化，表明hTR的水平保持不变。与细胞质中的情况相比，细胞核中的荧光强度在BIBR1532处理前后没有明显变化。通过逻辑处理检测了BIBR1532处理或未处理细胞的细胞质和细胞核的共聚焦区域，结果与之前的结果一致。因此，细胞质中的端粒酶更容易被BIBR1532利用，而BIBR1532药物起作用的主要位置是细胞质。通过分子模拟进一步研究了基于BIBR1532的端粒酶活性抑制机制。模拟结果表明，BIBR1532能与TERT的活性口袋结合，可抑制端粒酶中hTR模板与端粒酶蛋白C端延伸域（CTE）部分的结合，从而导致端粒酶活性下降。此外，TPP1还能特异性地将端粒酶募集到端粒上，BIBR1532与端粒酶的结合会使RNA偏离其最佳功能区，从而阻碍RNA与DNA的结合，导致DNA延长受到抑制。接下来，测试了另一种药物分子Sinefungin。Sinefungin是S-腺苷蛋氨酸的类似物，它是一种三甲基鸟苷合成酶1（TGS1）抑制剂，通过阻断2,2,7-三甲基鸟苷（TMG）帽的形成来干扰hTR的成熟。TGS1是稳定端粒-Cajal体相互作用的重要因素，并能负向调节hTR的丰度和端粒酶的活性，可通过减少2,2,7-TMG封顶来上调hTR的表达和端粒酶活性。从HeLa细胞在Sinefungin处理前后7天的荧光共聚焦图像来看，Sinefungin上调了hTR和端粒酶的活性。细胞核和细胞质中hTR和端粒酶活性的荧光强度也增加了。在细胞核中观察到明显的hTR累积。利用逻辑处理法检测了Sinefungin处理或未处理细胞的细胞质和细胞核的共定位区域，与细胞质相比，Sinefungin处理后细胞核中的共定位百分比显著增加，表明Sinefungin可以通过引导端粒酶到细胞核中的Cajal体来阻止端粒酶的降解。本研究构建了一个基于DNA的传感平台，通过整合目标可激活DNA纳米器件（DNA-ND），对hTR和端粒酶活性进行原位定位和成像。该平台具有DNA纳米技术的快速设计能力，可方便地对活细胞中两种常用的端粒酶标记物进行定位和成像。值得注意的是，荧光成像比较显示，hTR和端粒酶活性的位置并不完全重叠。这一发现强调了这两种成分在不同亚细胞区域内错综复杂的空间分布，揭示了端粒酶动态的复杂性。我们的方法的主要优势之一是通过DNA-ND对活细胞中的hTR和端粒酶进行正交荧光成像，从而克服了使用昂贵的免疫荧光试剂以及为获得稳定的荧光表达而进行长时间细胞培养等复杂操作所带来的局限性。此外，我们的平台还能持续观察细胞状态的变化，为端粒酶的动态行为提供有价值的见解。细胞状态的变化也可以连续观测。因此，我们观察到了BIBR1532和Sinefungin治疗对癌细胞中hTR和端粒酶活性的影响。总之，这项工作可能会为我们在亚细胞水平上了解hTR和端粒酶之间微妙的相互作用带来新的视角。预计未来还将有先进的治疗应用。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202409344制版人：十一
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