近日，上海交通大学生命科学技术学院谢志平研究员团队在Cell Death & Differentiation杂志上在线发表了题为Temporal dissection of the roles of Atg4 and ESCRT in autophagosome formation in yeast的研究论文。该项研究针对自噬机制领域的两个关键问题：一是Atg8去脂化生化反应的细胞生物学功能是什么，二是ESCRT在经典宏自噬中发挥多大贡献。研究发现Atg4催化的Atg8去脂化构成自噬体膜闭合的新通路，与ESCRT的晚期作用平行；发现ESCRT对自噬体形成动态存在双阶段双重调控，在形成周期早期通过控制PI3K复合体的招募而调控自噬体形成的起始频次。细胞自噬（autophagy）是真核细胞里依赖于溶酶体/液泡（lysosome/vacuole）的亚细胞降解途径。细胞自噬可以维持细胞健康，其活性异常与很多疾病的发生发展有密切关系。在自噬发生时，细胞中会形成一种双层膜的自噬体（autophagosome）来包裹并运输胞内待降解底物，如图1所示。在自噬体形成过程中，自噬体前期膜囊会经历扩展和形变，将待降解胞质组分包裹其中，进而闭合成为双层膜成熟自噬体。自噬体与溶酶体/液泡融合导致自噬体内膜以及包裹的底物被降解。自噬体的形成是宏自噬过程的核心步骤，也是细胞自噬研究的重点问题。图1. 细胞自噬的基本过程（图源：Zhiping Xie, et.al., Nat Cell Biol, 2007）
1. Atg4催化自噬体膜Atg8解离，促进自噬体膜闭合。
三十年前酵母自噬基因筛选发现了十余种真核域保守的核心Atg蛋白。时至今日，这些Atg蛋白分子的具体功能未完全明确。类泛素蛋白Atg8在几乎所有宏自噬研究中都被作为自噬体膜的标志物使用。Atg8与膜脂PE的偶联导致Atg8与自噬体膜结合。世纪之初的蛋白生化研究已经明确Atg4可以切割Atg8-PE释放膜上的Atg8，但这一生化反应的细胞生物学功能意义并不清晰。为了研究Atg4催化自噬体膜上Atg8解离的功能，排除Atg4在其他步骤和过程的作用，研究者在敲除内源ATG4细胞中表达Vac-Atg4融合蛋白将Atg4的活性限制在液泡膜临近空间。在这种背景（vac-atg4）下，新合成Atg8的末端酶切可以正常发生，脂化Atg8不会在非自噬体的膜结构积累，但自噬体膜上Atg8的解离被显著延缓。对自噬体形成周期的活细胞成像观察显示vac-atg4细胞自噬体形成频率正常，自噬体形成周期前半段各蛋白动态正常，延迟发生在后半段。通过对Atg8蛋白酶敏感性和自噬底物Ape1的蛋白酶敏感性检测进一步发现vac-atg4细胞里自噬体的闭合存在缺陷。Atg4切割Atg8促进自噬体膜闭合的活性可以在体外重构实验中复现：在含有未闭合自噬体膜的胞浆提取物中加入纯化的Atg4蛋白带来Atg8的去脂化和自噬体膜的闭合。2. 自噬体膜上Atg8的解离过程与ESCRT复合体独立影响自噬体膜的闭合。
ESCRT在内吞体成熟、病毒颗粒释放等多种膜闭合过程中发挥功能。近年有报道称ESCRT复合体也参入了自噬泡体的闭合。研究者接下来比较了Atg4介导的Atg8解离过程与ESCRT复合体在自噬体膜闭合过程中的关系。自噬底物Ape1蛋白酶K保护实验证实ESCRT与Atg4功能缺陷均造成自噬体膜闭合部分缺陷，二者叠加则造成更为严重的缺陷。而且，Atg4促进自噬体膜闭合的体外重构实验用ESCRT敲除细胞同样可以实现。这说明在自噬体膜闭合的过程中，Atg4-Atg8体系和ESCRT独立发挥功能。这在一定程度上解释了为何Atg4促进自噬体膜闭合的作用没有在早期自噬研究中被关注，因为其单独缺失仅影响闭合的一条路径，还有ESCRT控制的另一条路径可以运行。历史上，ESCRT的发现与ATG基因的筛选几乎同期发生。早期自噬学者的蛋白功能研究常以ESCRT敲除细胞为背景进行自噬相关透射电镜研究，因为当时研究认为ESCRT非自噬必须，其缺失可避免电镜下内吞体成熟形成的小囊泡对自噬体识别的干扰。在动物模式系统的研究也曾报道ESCRT对宏自噬贡献有限。而18-20年三组学者独立报道了ESCRT在自噬体膜闭合中发挥功能。目前，领域中对ESCRT在宏自噬中的重要性存在争议。膜闭合平行通路的发现可以为这些争议提供一部分解释，而研究对自噬体形成周期的量化分析则可为ESCRT相关争议提供另一部分解释。自噬体形成的过程可以通过活细胞连续拍摄观察。本项研究对不同自噬蛋白在自噬体形成周期中的动态变化进行了统计分析。典型的自噬体形成周期耗时5-10分钟。周期始于自噬形成位点 (PAS) 骨架的组装，1分钟后PI3K、Atg8开始组装；在Atg8招募达到顶峰时，PAS骨架、PI3K基本结束了其各自的组装-解离流程；最后，Atg8、Atg1逐渐解离，成熟的自噬体与液泡融合消失。如前所述，vac-atg4细胞中自噬体形成起始的频率和周期前半段的动态特征基本正常，提示Atg4控制的Atg8解离主要影响周期后半段。而ESCRT缺失的影响则更为复杂。与其影响自噬体膜闭合的结论一致，ESCRT缺失细胞中自噬体形成周期长度也明显拉长。但与vac-atg4细胞不一样的是，ESCRT缺失细胞PI3K复合体的组装频率减半。ESCRT缺失细胞Atg9运输的异常是PI3K组装缺陷的重要原因。ESCRT这种双阶段作用模式在对细胞进行静态观察时会造成一种假象，即以Atg8标记的自噬体数量看起来时正常的，而实际上这种静态数量的”正常”源于形成起始频率和形成周期时长的双重缺陷。早期自噬研究由于显微镜硬件性能限制，活细胞连拍的使用没有现在常见，容易误认为ESCRT不影响自噬。膜闭合是细胞生物学中普遍存在的膜动态过程。长期以来，膜闭合研究对ESCRT关注较多。该研究发现Atg4-Atg8系统独立于ESCRT促进膜闭合，为理解膜闭合的基本规律提供了新的角度。Atg4-Atg8体系、ESCRT在自噬中均发挥不止一种功能。该研究通过对自噬体形成周期动态特征的分析分解Atg4-Atg8体系、ESCRT的多种功能，同样思路也可用于其他多功能蛋白多重功能的发现与分解。上海交通大学谢志平研究员为本文的通讯作者，上海交通大学生命科学技术学院博士后李辉、已毕业博士研究生宋敬臻和何承文为本文的共同第一作者。上海交通大学生命科学技术学院博士生张正坦、周游、李鑫靖和硕士生谢孟希也参加了该研究。特别感谢上海交通大学龚清秋博士在本研究的过程中给予的帮助。https://doi.org/10.1038/s41418-024-01438-8制版人：十一
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