推断和扰动人类大脑类器官中细胞命运的调控组

该研究基于利用多能干细胞生长的自组织神经类器官，结合单细胞基因组技术，提供了一个机会来检查人类大脑发育背后的基因调控网络。研究者们通过在人类类器官中获取单细胞转录组和可接近染色质数据，覆盖了神经上皮形成、模式形成、大脑区域化和神经发生的密集时间过程，并识别出随时间动态变化和大脑区域特异性的调控区域。通过这些数据，研究者们开发了Pando框架，这是一个灵活的框架，结合多组学数据和转录因子结合位点的预测，来推断描述类器官发育的全局基因调控网络。此外，通过单细胞转录组读数的群体遗传扰动，评估了转录因子在类器官中对细胞命运和状态调控的需求。研究发现某些因子调节细胞命运的丰度，而其他因子影响分化后神经细胞状态。通过这些研究，提供了一个框架，展示了如何利用人类模型系统和单细胞技术来重建人类发育生物学。

图1展示了通过多组学数据构建的大脑类器官发育的多组学图谱，揭示了发育层次和关键命运决策阶段。图中通过UMAP（均匀流形近似和投影）嵌入技术展示了从多能干细胞到不同大脑区域的神经前体细胞（NPCs）和神经元的连续分布，包括背侧和腹侧大脑半球的神经祖细胞和神经元，以及非大脑半球区域的细胞类型。图中还展示了通过RNA测序（scRNA-seq）和ATAC测序（scATAC-seq）获得的单细胞数据，以及通过RNA速度和CellRank算法推断的神经发育轨迹，从而揭示了大脑类器官在区域化和神经发生过程中的细胞状态转变和调控网络。

图2描述了利用Pando算法推断出的人类大脑类器官发育的基因调控网络（GRN），展示了如何通过结合单细胞转录组和染色质可接近性数据来构建这一网络。图中首先展示了Pando框架的流程，包括识别候选调控区域、预测转录因子结合位点、为每个目标基因选择调控区域，并构建一个回归模型来推断基因表达与调控区域的关系。接着，通过UMAP嵌入技术展示了推断出的转录因子网络，这些转录因子根据共表达和推断的相互作用强度进行分组，反映了大脑类器官发育过程中细胞状态转换的伪时间顺序。此外，图中还展示了特定转录因子模块的活性如何随着大脑区域化和神经发育的不同阶段而变化，以及如何通过分析不同大脑区域分支中推断出的结合位点的差异可接近性来识别具有高度分支特异性的转录因子。这些分析为理解人类大脑区域化和转录因子介导的细胞编程提供了丰富的资源。

图3概述了在大脑类器官中进行的转录因子扰动实验，揭示了调控神经发育命运决策的关键转录因子。实验通过CRISPR-Cas9筛选技术对20个转录因子进行靶向，并在60天大的类器官中通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和扩增子测序分析了这些扰动对细胞命运的影响。图中展示了不同gRNA在不同大脑区域的富集情况，以及它们对细胞类型组成的影响。特别地，图3强调了GLI3和HES1这两个基因在调控背侧大脑皮层命运中的拮抗作用，以及E2F2在影响神经元转录组状态中的作用。此外，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术生成的GLI3敲除(KO)细胞系用于确认GLI3在人脑发育中的作用，并通过比较野生型(WT)和KO细胞的单细胞多组学数据，进一步阐明了GLI3在大脑发育不同阶段的调控作用。

图4详细展示了GLI3基因敲除（KO）对大脑类器官发育过程中背侧-腹侧神经命运规范的影响。通过单细胞多组学数据，研究者们揭示了GLI3在早期大脑类器官发育中的直接和间接靶基因，以及这些基因在背侧和腹侧大脑皮层命运建立中的作用。图中展示了GLI3 KO与野生型（WT）细胞在不同发育阶段的基因表达和染色质可及性的差异，以及GLI3如何通过激活HES4、HES5和PAX6等基因来促进背侧大脑皮层命运，同时通过调节其他基因如BCL11A、LHX8和NKX2-1来抑制腹侧大脑皮层的命运。此外，通过比较SHH处理和GLI3 KO的细胞，研究者们提出了SHH通过抑制GLI3来促进腹侧化的模型，从而揭示了GLI3在人脑发育中的多阶段调控作用。

该研究通过结合单细胞转录组和染色质可及性数据，利用多模态单细胞基因组技术和人类大脑类器官模型，揭示了人类大脑发育的基因调控网络（GRNs），并特别强调了转录因子GLI3在调控背侧大脑皮层命运建立中的关键作用。研究者们开发了Pando算法来推断和分析这些复杂的基因调控互作，并通过对GLI3进行基因编辑实验，证实了其在人类大脑发育中的必要性，同时揭示了GLI3通过不同的调控网络影响大脑区域化和神经细胞状态的多阶段作用。此外，该研究还通过CRISPR-Cas9筛选技术在类器官中进行了转录因子扰动实验，进一步理解了这些转录因子在神经发育中的功能，为未来研究人类大脑发育和相关疾病提供了宝贵的资源和框架。

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