横纹肌肉瘤(RMS)是儿童中最常见的软组织肉瘤,约占所有儿童癌症的3-4%。在PAX3/7-FOXO1融合阳性(FP-)和融合阴性(FN-)RMS中FGFR4的高表达,但在正常组织中低或缺失。这使得FGFR4成为RMS的可追踪分子靶点。
CD276(B7-H3)是另一个属于重要免疫检查点B7家族的细胞表面蛋白,在包括RMS在内的多种人类实体瘤中的过表达,并且其过表达与多种恶性肿瘤的肿瘤进展、转移和不良临床结果相关。此外,PAX3-FOXO1在FP-RMS中上调CD276表达,目前正在作为人类癌症CAR T细胞疗法的靶点进行研究。因此,CD276是针对RMS的额外靶点。
第二代CAR设计允许通过选择单链可变片段(scFv)结合物、铰链跨膜(HTM)和细胞内共刺激结构域(CSD)进行广泛定制,它们共同决定了CAR的激活阈值和信号传导特性。作者团队基于之前的研究,在优化了使用不同HTM和CSD的FGFR4 CAR的抗肿瘤活性后,测试了靶向FGFR4和CD276的双价CAR(BiCisCAR),并比较了它们在几个RMS体内模型中的治疗效果。
图1展示了通过改变CAR T细胞中的铰链和共刺激域来增强FGFR4 CAR T细胞对RMS异种移植物的抗肿瘤活性。研究者之前报道了使用CD8α链和4-1B共刺激域的FGFR4 CAR T细胞能够有效根除NSG小鼠中侵袭性RH30 FP-RMS异种移植物。但是在压力条件下,仅使用2.5百万CAR T细胞时,肿瘤无法被消除。为了提高CAR活性,研究者将原始FGFR4 CAR的链和共刺激域替换为CD28链和共刺激域。在两个RMS异种移植物模型上测试了这些改变的疗效。结果显示,FGFR4.28HTM.BBz和FGFR4.28HTM.28z CAR T细胞在体内显示出比原始FGFR4 CAR T细胞更强的抗肿瘤活性,且在RH30异种移植物模型中,仅2.5百万的T细胞即可产生显著的抗肿瘤反应。FGFR4.28HTM.28z CAR在更具侵袭性的RMS559异种移植物中显示出更好的肿瘤控制能力。研究还评估了不同共刺激域CAR T细胞在小鼠血液中的扩增和耗竭倾向,发现FGFR4.28HTM.28z CAR在RH30异种移植物模型中显示出比原始设计更好的持续性,但在RMS559模型中表现出更高的耗竭标志物表达。这些数据表明,CD28链域在第二代CAR设计中赋予了比CD8链更大的肿瘤杀伤活性和更好的持续性。尽管CD28共刺激域与较短的持续性和增加的T细胞耗竭有关,但使用CD28链和共刺激域的FGFR4 CAR在更具侵袭性的RMS559异种移植物中显示出显著增强的抗肿瘤活性,导致生存期延长。
图2展示了在横纹肌肉瘤(RMS)细胞中FGFR4和CD276两种表面抗原的识别和量化分析。通过ChIP-seq数据分析,研究者确认了CD276是PAX3-FOXO1在FP-RMS细胞系中的一个靶点,并且在多个RMS细胞系中检测到了与CD276位点相关的H3K27ac和MYOD1的结合,表明CD276在RMS细胞中的活跃表达。流式细胞仪测量显示,RMS细胞系和患者来源异种移植物(PDX)平均表达6150个FGFR4分子和41577个CD276分子。此外,研究者发现在7个RMS PDX上平均有1614个FGFR4分子和3957个CD276分子,表明在所有RMS样本中两种抗原的表达存在显著的肿瘤内和患者间变异性。这些数据表明,同时靶向这两个抗原可能更有效地防止CAR T细胞疗法中的免疫逃逸。
图3展示了双靶向FGFR4和CD276的BiCisCAR T细胞对RH30和RMS559异种移植物肿瘤的清除效果。研究发现,CD276 CAR T细胞显著缩小了肿瘤,但未能在所有治疗的小鼠中消除肿瘤。为了解决可能导致抗性的靶抗原异质性表达问题,研究者生成了3种编码双靶向FGFR4和CD276的BiCisCAR,通过自切割连接子允许同一T细胞中共同表达两种CAR。在体外实验中,表达三种BiCisCAR的T细胞具有相似的CAR转导效率、FGFR4和CD276结合能力、CD4/CD8比例或记忆T细胞分化表型,并且在1:10的效应:肿瘤比例下对RH30显示出高肿瘤杀伤能力。然而,共享CD8链和4-1B共刺激域的FGFR4.8HTM.Bz-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR在RH30异种移植物模型中仅延迟了肿瘤进展。相比之下,FGFR4.28HTM.Bz-CD276.8HTM.Bz和FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR在所有小鼠中完全根除了肿瘤,后者显示出更快速的肿瘤消除。FGFR4.28HTM.28zCD276.8HTM.Bz BiCisCAR T细胞在体外显示出比FGFR4.28HTM.Bz-CD276.8HTM.Bz更高的肿瘤杀伤活性。在体内实验中,表达FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR的T细胞表现出更快的肿瘤根除、增加的持久性和降低的耗竭标志物表达。这些结果表明,双靶向BiCisCAR T细胞在治疗RMS中具有显著的抗肿瘤活性和持久性。
图4展示了在应激条件下,FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBz BiCisCAR T细胞显示出优越的扩增、肿瘤浸润和有限的耗竭。研究者测试了包括两个FGFR4靶向CAR(FGFR4.28HTM.BBBz和FGFR4.28HTM.28z)、一个CD276靶向CAR(CD276.8HTM.BBz)以及两个BiCisCAR(FGFR4.28HTM.Bz-CD276.8HTM.Bz和FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz)在高应激模型中,其中仅使用100万CAR T细胞治疗侵袭性RMS559异种移植物。两个FGFR4靶向CAR和FGFR4.28HTM.Bz-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR显示出最小的抗肿瘤活性,而CD276靶向CAR在5只清除了2个肿瘤。相比之下,FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR显示出最高的效力,控制了4个肿瘤,在5个肿瘤中,伴随着显著的细胞扩增。与CD276.8HTM.Bz相比,FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCAR T细胞在血液中和肿瘤中显示出最高的CAR T细胞计数。表达耗竭标志物的T细胞比例在肿瘤中(CD39和Tim-3)和血液中(CD39和LAG-3)显著低于其他CAR。这些发现与这种BiCisCAR的增强和快速抗肿瘤活性一致。FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR超越了所有其他单靶向CAR和双靶向BisCAR,显示出最强大的扩增和最少的耗竭。
图5展示通过多模式的单细胞分析揭示了FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR T细胞的独特表型,并确认了其在功能上优于其他CAR T细胞。研究者使用14个蛋白标记在CAR T细胞治疗后11天从JR肿瘤携带小鼠中分离出的肿瘤浸润T细胞(TIL)上通过测序(CITE-Seq)对转录组和表位进行了细胞索引。分析了整合的蛋白质和转录组数据,识别出13个不同的细胞群,包括CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、CD4+或CD8+混合T细胞、γδ T细胞和NK样T细胞。这些细胞群的表达特使研究者可以分析每种T细胞亚型。例如,CD276.8HTM.Bz CAR T细胞在CD4+和CD8+细胞群中显示出最高的激活T效应细胞比例。FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR显示出在CD8+ T细胞群中更高的效应记忆细胞和颗粒酶阳性效应T细胞比例。通过差异表达分析发现,FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR T细胞在肿瘤浸润细胞中优先表达与抗肿瘤活性相关的基因,如穿孔素和多种颗粒酶。这些数据表明FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR T细胞在体内迅速扩增至生成效应和记忆亚群。
图6展示了BiCisCAR T细胞在体内克服FGFR4和CD276异质性表达的能力。研究者通过CRISPR-KO技术在RH30细胞中创建了FGFR4或CD276的克隆,预期单CAR T细胞无法消除缺乏目标抗原的RH30细胞。相比之下,FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.Bz BiCisCAR T细胞无论FGFR4或CD276是否存在,均表现出一致的细胞毒性。为了在体内模型中模拟肿瘤抗原的异质性表达,研究者建立了双侧异种移植物,RH30 FGFR4-KO(右腿)和CD276-KO(左腿)。与体外数据一致,单CAR T细胞仅在相应目标抗原存在时表现出选择性肿瘤缩小或根除。相比之下,双靶向CAR T细胞在两侧均有效根除肿瘤。值得注意的是,FGFR4单靶向CAR T细胞仅根除了3个FGFR4+肿瘤,而BiCisCAR根除了所有FGFR4+肿瘤,表明BiCisCAR对FGFR4+RH30肿瘤具有增强的抗肿瘤活性。这一观察与这些CAR在持久性和耗竭方面的特性一致。
图7展示了双靶向CAR T细胞(BiCisCAR)在同时具有CD28和4-1BBB共刺激域(CSD)时,如何导致增强的CAR信号强度和持续的T细胞激活信号。图A、B和C显示了FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBBz BiCisCAR T细胞在与单独的FGFR4或CD276刺激以及双重刺激相比,释放IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子的水平,表明在双重刺激下细胞因子的产生具有协同效应。图D的Western blot分析揭示了在FGFR4和CD276双重刺激下,BiCisCAR T细胞中CAR-CD3ζ、ZAP70、PLCγ1、p65、Akt和Erk1/2的磷酸化水平,与单独刺激相比,双重刺激导致了更高的磷酸化水平,表明不同的CSD可以激活互补的信号通路下游TCR,增强T细胞的激活反应。图E提供了一个总结图,概述了FGFR4.28HTM.28z-CD276.8HTM.BBz BiCisCAR T细胞在FGFR4和CD276双重刺激下的激活信号通路。这些结果表明,同时拥有CD28和4-1BBB CSD的BiCisCAR T细胞在细胞因子产生上表现出强烈的协同效应,并且在激活信号传导上显示出更高的磷酸化水平,这可能增强了CAR T细胞的抗肿瘤活性。
总结来说,作者团队优化了一种双靶向的BiCisCAR T细胞,它具有两种不同的HTM和CSD,展现出有利的内在特性,如增强的信号传递、快速的扩增扩、增强的效应和效应记忆T细胞的分化、持续的持久性和减少的耗竭。同时,它有效地解决了由异质性靶标抗原表达所带来的挑战。这些属性不仅促进了快速的肿瘤根除和长期的疗效,而且还降低了因抗原逃逸而导致复发的风险。这种和其他类似设计的BiCisCAR的临床开发为患有侵袭性实体瘤的患者提供了强大而有效的治疗新方案。