CD19 CAR-T细胞治疗已经取得了很好的反响，但由于持续性差，治疗后仍然会出现复发。目前广泛研究了各种方法来改善CAR-T细胞的功能，包括细胞内信号域的修改。细胞内结构域通常由一个或多个介导有利T细胞活化和持久性的共刺激结构域和一个主要的T细胞激活基序组成，即CD3复合体的ζ亚基（CD3ζ）。
核因子-κB （NF-κB）的活化在促进CAR-T细胞的寿命和肿瘤杀伤活性方面发挥着重要作用13，因为受到刺激后，T细胞和B细胞均存在下游信号传导。NF-κB信号分为两条主通路：经典和非经典，它们在刺激、反应和生物功能上有所不同。例如，通过T细胞受体（TCR）和CD28共刺激域（TCR/CD28）刺激的规范途径导致快速和短暂的信号。CD40是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的成员，它在B细胞上广泛表达，触发非经典途径，有助于缓慢但具有持续性的NF-κB。
为了最大化CAR-T细胞的效力，作者团队假设T细胞和B细胞信号分子CD28和CD40（CD28.40z）的结合将协同经典和非经典NF-κB信号，并增强 CAR-T 细胞治疗所需的强烈杀瘤活性和 T 细胞持久性。使用第三代CD19 CAR-T和CD37 CAR-T细胞对B细胞恶性肿瘤进行了CD28/CD40共刺激域的功能增强研究。
图1展示了CD19CAR-T细胞的生成和T细胞信号传导分析，特别是CD28/CD40共刺激域在CD19CAR模型中对NF-κB信号通路的促进作用以及对NFAT信号通路的抑制作用。图A展示了CD19CAR结构的示意图，其中包括了CD28/CD40（CD28.40z）、CD28（CD28z）、4-1BB（BBz）或CD40（CD40z）共刺激域与抗CD19CAR骨架的融合。图B描述了CD19CAR-T细胞的生成过程。图C显示了转导后7天，通过tEGFR表达对原代人T细胞进行预选和后选的代表性流式细胞图。图D展示了来自五个不同供体的CD19CAR-T细胞的转导效率和纯化效果。图E和图F分别展示了未转导的T细胞和纯化的CD19CAR-T细胞对EGFR和CD19CAR FMC63表达的代表性流式细胞图和表达数据。图G显示了在CD19CAR-T细胞中，pNF-κB和pRelB的磷酸化水平在基线时显著升高。图H利用Jurkat三参数报告细胞（TPR）验证了CD28/CD40共刺激域在转录水平上的信号传导，显示CD19.28.40z CAR-T细胞在CD19抗原刺激下产生了较低水平的NFAT活性，而CD19.40z CAR-T细胞产生的NF-κB活性较其他共刺激域低。这些结果表明，CD28/CD40共刺激域在CD19CAR-T细胞中促进了高NF-κB下游信号传导，并且在CD19特异性刺激下产生了较少的NFAT信号。
图2展示了CD19.28.40z CAR-T细胞在CD19抗原刺激下的增殖能力和细胞因子分泌情况。在没有IL-2补充的条件下（图2A左），以及有IL-2补充的条件下（图2A右），CD19.28.40z CAR-T细胞显示出比其他CAR结构更高的扩增倍数，尤其是在没有外源性IL-2的情况下。图2B显示了在短期（4小时）和长期（16小时）与CD19+抗原孵育后，CD19.28.40z CAR-T细胞与CD19.28z CAR-T细胞相比，分泌了更高比例的IL-2，并且在过夜育后仍然保持较高的IL-2分泌水平。CD19.28z CAR-T细胞在短期和长期育后显示出较高的干扰素γ（IFN-γ）产生趋势。图2C和图2D进一步评估了CD19CAR-T细胞在重复靶细胞刺激下的细胞毒性活性，结果表明，CD19.28.40z CAR-T细胞在所有效应器与靶细胞（E:T）比例下都能持续消除肿瘤细胞，而其他CAR结构在实验结束时肿瘤细胞开始复发。这些结果表明，CD19.28.40z CAR-T细胞的增殖能力和内源性IL-2分泌的增强，有助于提高抗肿瘤效果。
图3展示了CD19.28.40z CAR-T细胞在经历重复抗原刺激后的增殖能力和免疫表型变化。研究者通过每周一次的γ-辐射NALM-6细胞刺激，对CD19CAR-T细胞进行了连续三周的抗原刺激，并补充了IL-2。结果显示，与其它CAR结构相比，CD19.28.40z CAR-T细胞在重复刺激后显示出显著的扩增和增殖能力（图3B）。通过CD45RA和CD62L的染色，研究者评估了T细胞分化状态，发现CD19.28.40z CAR-T细胞在多次刺激后仍保持了较高的中央记忆T（TCM）细胞比例和较低的耗竭表型（图3C和图3D）。此外，通过RNA测序贯分析，研究者发现CD19.28.40z CAR-T细胞中与T细胞增殖、记忆形成和NF-kB信号通路相关的基因表达上调，而与凋亡、耗竭和糖酵解通路相关的基因表达下调（图3E和图3F）。这些结果表明，CD19.28.40z CAR-T细胞在重复抗原刺激下能够维持较高的增殖能力，并且T细胞分化和耗竭表型未受显著影响。
图4展示了在B-ALL小鼠模型中，CD19.28.40z CAR-T细胞对肿瘤的清除效果。实验中，NALM-6细胞系被注入NOD-SCID common-γ chain knockout (NSG)小鼠体内，模拟B-ALL疾病。随后，小鼠被注射了不同种类的CAR-T细胞，包括tEGFR-T、CD19.28z CAR-T、CD19.BBz CAR-T和CD19.28.40z CAR-T细胞。通过生物发光成像（BLI）技术监测肿瘤负担，结果显示CD19.28.40z CAR-T细胞能够显著抑制肿瘤细胞生长，与对照组相比，其平均辐射度的快速且持续的抑制效果导致了整体生存率的显著提高。而CD19.28z CAR-T和CD19.BBz CAR-T细胞则显示出不均匀且效果不佳的肿瘤抑制，导致短期生存。实验还评估了T细胞转移后7天小鼠外周血中人CD3+细胞的存在情况，以及小鼠体重和血清中IFN-γ和IL-6的浓度，以确定CAR-T共刺激域是否影响细胞因子释放综合征。结果表明，接受CD19.28.40z CAR-T细胞治疗的小鼠在整个观察期间体重保持稳定，而对照组小鼠则出现体重下降。血清细胞因子浓度在不同CAR-T结构之间没有显著差异。综上所述，CD19.28.40z CAR-T细胞在小鼠模型中有效地根除了B-ALL并延长了生存期。
图5描述了CD19.28.40z CAR-T细胞在B-NHL小鼠模型中对肿瘤的长期控制效果。实验中，NSG小鼠被注射Raji/ffluc-GFP细胞以模拟B-NHL，随后在第7天接受CD19CAR-T细胞治疗。通过生物发光成像（BLI）监测，CD19.28.40z CAR-T细胞治疗组的小鼠显示出比tEGFR-T和CD19.BBz CAR-T细胞治疗组更有效的肿瘤抑制和更持久的生存期。在治疗后100天，CD19.28.40z CAR-T细胞治疗的小鼠中，中央记忆T（TCM）细胞的比例显著高于CD19.28z CAR-T细胞治疗组，表明其具有更强的免疫记忆能力。当这些小鼠在第100天再次接受Raji-ffluc细胞挑战时，CD19.28.40z CAR-T细胞治疗组的小鼠能够维持长期肿瘤控制，而CD19.28z CAR-T细胞治疗组的小鼠则出现了肿瘤进展。在实验结束时，CD19.28.40z CAR-T细胞治疗组的小鼠骨髓中存在大量的中央和效应记忆T细胞，以及TCF-1阳性细胞，这些细胞是长期记忆形成的标志。此外，这些小鼠的体重和血清细胞因子水平与B-ALL模型中的小鼠相似，表明CD19.28.40z CAR-T细胞治疗具有良好的安全性。这些结果证实了CD19.28.40z CAR-T细胞在体内具有显著的抗肿瘤效果和持久的免疫记忆能力。
图6展示了CD37.28.40z CAR-T细胞在体外实验中的功能增强。图A展示了CD37CAR结构的示意图，其中CD28/CD40共刺激域被融合到抗CD37CAR骨架中。图B显示了CD37CAR-T细胞的转导效率和纯化程度。图C评估了在没有外源性IL-2补充的情况下，CD37CAR-T细胞与CD37+靶细胞共培养的增殖能力，结果表明CD37.28.40z CAR-T细胞与其他对照组相比具有更强的增殖能力。图D和图E分别展示了CD37CAR-T细胞在与Raji细胞共培养前后的T细胞分化亚群和耗竭标志物的百分比，其中CD37.28.40z CAR-T细胞在抗原暴露后保持了更多的初始T细胞表型，并显示出较低水平的LAG3+和PD-1+耗竭细胞。图F显示了在没有IL-2补充的情况下，CD37CAR-T细胞与Raji/ffluc细胞长期共培养的细胞毒性，CD37.28.40z CAR-T细胞能够有效抑制肿瘤细胞生长，而其他CAR构建体则早期出现肿瘤细胞生长。这些发现验证了CD28/CD40信号分子在CD37CAR-T细胞中的功能增强，导致了对CD37阳性肿瘤细胞的优越T细胞增殖和细胞毒性。
作者团队的研究通过构建包含CD28/CD40共刺激域的CD19和CD37特异性CAR-T细胞，探讨了这种设计对增强T细胞增殖、持久性和抗肿瘤活性的影响。研究发现，CD19.28.40z和CD37.28.40z CAR-T细胞在体外实验中表现出更强的增殖能力和较低的耗竭标志物水平，并且在体内模型中显著提高了肿瘤清除效果和生存率。这些结果表明，CD28/CD40共刺激域的引入能够显著提升CAR-T细胞治疗的疗效，为未来的临床应用提供了有价值的策略。
