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1、微阵列比较基因组杂交在产前诊断中意外检出Duchenne肌营养不良基因变异的回顾性分析
孕妇34岁,孕1产0,籍贯上海,家族中其舅舅、弟弟均患杜氏肌营养不良症 (duchenne muscular dystrophy, DMD),于少年期死亡。该孕妇非近亲结婚,孕18周,要求产前诊断,转入我院。孕期无特殊,B超提示胎儿与孕周相符,未见异常。入院后 B超引导下行羊膜腔穿刺,诊断胎儿为男性后行胎儿脐带血穿刺,抽取胎儿血化验肌酸磷酸激 酶,并按常规方法提取 DNA。同时取孕妇外周血做 DNA 检测。按照 Beggs等[1]和 Chamberlain等[2]方法设计了16对引物,包含肌营养不良蛋白(dystrophin)基因启动子(Pm)、 外显子3、6、8、13、17、19、43-52(46、51除外)及60易发生基因缺失热点区,引物由北京三博远志生物技术有限公司提供。DNAPCR扩增均分两次在2个反应管中进行,分别用 9对引物[1]和7对引物[2],前者方法同文献[1],后者与文献 [2]大体相同,将退火温度改为 54℃。取反应液 10 DNA 大小标记物同时点样于1.4%琼脂糖凝胶中,80 μ V l和电压电泳1h。孕 妇 外 周血和胎儿血结果见表 1,显示脐 血 CPK、CK-MB和 LDH 均显著升高;AST 轻度异常。孕妇相应酶学亦有轻度改变。PCR 扩增结果如图1示:胎儿外显子47、50、52、45、48、49有基因缺失,孕妇为携带者,相应条带较正常阳性对照的条带有减弱。向家属交代病情后,要求终止妊娠,于孕23周行药物引产,娩一男死胎,外观未见明显异常。
DMD是一种严重致死性 X 连锁隐性遗传病,发病率为1/3500活男婴,临床表现以肌肉进行性萎缩和无力为特征,患者一般在20岁前死亡。由于本病目前无有效的治疗方法,只能进行产前基因诊断杜绝患儿的出生。DMD 基因位于Xp21区,长2200kb,cDNA 全长14kb,含79个外显子。已报道65%的基因突变为大片段缺失,5%~10%为复制,25%~30%为点突变、小缺失或小插入,基因突变的大 热点区为外显子44~53、小热点区位于基因5′端[3]。目前 的基因检测方法有多 重 PCR、定量多重PCR、Southern杂交、RT-PCR和 FISH 等。国内、外关于 DMD 产前基因诊断已有报道[4-6],王敏等[4]应用荧光标记聚合酶链反应扩增 9个微卫星片段,进行基因型分析成功诊断了1例 DMD 患病胎儿;曾溢滔等[5]在取得中国人 Xp21区限制性片段长度 多态性基础上,应用连锁分析对2例 DMD 高危妊娠进行了产前诊断。鉴于60%的患者基因异常为缺失,故建立一种简便而有效的缺失检出方法具有重要的意义。Beggs等[1] 和 Chamberlain等[2]设计了18对引物,可使缺失病例的检 出率达到90%以上。本文中未包含该基因的外显子4、12、 51,增添了外显子50来进行 PCR扩增。结果显示缺失的分布主要集中在外显子47、50、52、45、48、49,与国外的基因缺失热点区分布相似,结合脐血肌酶结果,考虑该胎儿为 DMD 患儿,予终止妊娠。Emery等[7]对高危 DMD 的胎儿血的CPK 数值及肌肉活检结果进行了研究,结果提示单纯根据胎儿血肌酶结果诊断 DMD存在假阴性,应结合病理检查或分子生物学实验结果来综合判断。实验中应用的多重PCR 方法,在数小时内可检出 DMD基因的缺失,操作简便,无需特别仪器,扩增后对结果的判定也比较直观和容易,因此多 重 PCR 是一种简便、快速的适于推广的检测 DMD 基因缺失的方法。但该方法不能解决非缺失病例的诊断,可进一步通过扩增微卫星片段或在限制性片段长度多态性基础上应用连锁分析进行 DMD的产前诊断。
由于孕妇为携带者,其出院后需指导其下次妊娠:(1)人工受精,进行精子性别选择,去除“Y”精子,使其受孕女婴, 可靠性约80%;同时对女婴进行产前诊断,检出致病基因携带者的几率为50%。(2)如受孕仍为男性,再发生同样疾病的可能性为50%;必须经产前诊断,如除外致病基因缺陷, 证实该男胎为正常人,其后代可不再受此病困扰。
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