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引用格式：李昌崇,陈尚勤,陈超,等. 围产期大鼠肺MMP2和Ⅳ型胶原表达及地塞米松对其的影响[J].中华围产医学杂志,2005,8(05)：342-345. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2005.05.019李昌崇 陈尚勤 陈超 郑亚兵 杨毅 朱列伟 陈莲 林振浪作者单位:325027 浙江温州医学院附属儿童医院呼吸科(李昌崇),新生儿科(陈尚勤、林振浪);上海复旦大学附属儿科医院新生儿科(陈超),儿科研究(杨毅),病理科(朱列伟、陈莲);浙江乐清市中医院儿科(郑亚兵)目的 观察大鼠围产期不同时间点(孕20d胎鼠,1、4、10、14 日龄鼠)的肺组织MMP2、Ⅳ型胶原表达的变化,并通过对孕鼠注射地塞米松(dexamethasone,DXM),观察其影响。方法 24只SD孕大鼠随机分为两组,每组12只。于孕18,19,20d,对照组各肌注0.5ml生理盐水;DXM组肌注DXM0.8mg/(kg·d),取孕20d胎鼠和生后4、10d鼠肺组织,行病理切片,免疫组化染色,计算机图像分析胎鼠和4、10日龄鼠MMP2以及4、10日龄鼠Ⅳ型胶原的分布与表达强度。逆转录聚合酶链反应技术检测肺组织匀浆MMP2mRNA 的表达。 结果 正常4日龄鼠肺囊泡MMP2的表达(20.14±3.39)较胎鼠增强(16.35±2.36),10日龄鼠略下降(15.93±1.94);各日龄DXM 组鼠肺MMP2的表达较对照组减少,两者差异有统计学意义(P <0.01)。DXM 组胎鼠、1、4、10日龄鼠肺MMP2mRNA表达均较对照组下调,以4日龄鼠下调最明显(0.376±0.132),胎鼠、1、4日龄鼠比较差异有统计学意义(P 均<0.01)。正常4、10日龄鼠肺基底膜的Ⅳ型胶原表达呈不连续线状,间有缺损,量较少,色浅;DXM 组鼠肺基底膜的Ⅳ型胶原表达多、色较深、呈连续的线状,表达量、阳性强度明显上调。 结论 孕后期使用地塞米松会抑制新生肺组织的MMP2的表达,使Ⅳ型胶原的降解减少,阻碍基底膜的发育,从而影响肺泡发育。
【关键词】 地塞米松;肺泡;大鼠;明胶酶A;胶原Ⅳ型
产前糖皮质激素治疗(antenatal corticorsteriodtherapy,ACT)作为预防新生儿呼吸窘迫综合征的常规手段目前已广泛应用于临床[1],但随着ACT重复应用增多,糖皮质激素对胎儿、新生儿的肺发育的不良影响正在引起国内外学者的关注。哺乳动物肺发育阶段离不开细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的重建,基底膜(basement membrane,BM)结构是ECM的特殊部分,Ⅳ型胶原是BM的主要成分[2],其在发育期的变化对细胞间相互作用,增殖、分化等至关重要。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是降解ECM的主要介质,在正常的胚胎发生、器官形成、组织塑型、创伤修复中起着重要作用[3],其中MMP2主要作用于BM的Ⅳ型胶原[4],调节肺泡发育中BM的变化。本实验通过对孕鼠注射地塞米松(dexamethsone,DXM),观察孕20d胎鼠,1、4、10、14日龄鼠的肺组织MMP2及Ⅳ型胶原表达的变化,现报告如下。
材料和方法
一、实验动物分组及实验过程
SD 孕大鼠(复旦大学医学院动物实验中心提供)共24只,随机选12只于孕18、19、20d各肌注DXM0.8mg/(kg·d)(均以生理盐水稀释至0.5ml),4只于孕20d剖宫产取胎仔16只,取全肺做病理和匀浆各8只。另8只孕足月大鼠(21~22d)自然分娩当天每窝随机取2只,共16只取全肺做匀浆。余下足月新生鼠养大,至4d取16只,取肺做病理和匀浆。至10d取16只,取肺做病理和匀浆。至14d取16只,取肺做匀浆。对照组:随机取12只孕18d大鼠,于孕18、19、20d各肌注生理盐水0.5ml,后续分组如模型组。因有7只孕鼠产仔较少,且产前注射DXM的孕鼠所产之仔鼠有夭折,故养至10和14d只数减少,每组不足8只。
二、实验方法
1. 标本的留取:(1)胎鼠:分离肺组织,随机取8只立即浸入10%中性缓冲甲醛溶液,另随机取8只置液氮保存留做匀浆。(2)1日龄鼠:右心室穿刺留置灌注冷生理盐水,剪开左心房放血,待左心房流出液体变清,分离出全肺(剪除气管组织),置液氮保存。(3)4、10、14日龄鼠:右心室穿刺留置灌注冷生理盐水,剪开左心房放血,结扎右支气管,剪取右肺置液氮保存;同时气管给20cmH2O
的气道压力扩张肺泡,1min后逐渐调低至10cmH2O维持,待左心房流出液体变清后改用10%中性缓冲福尔马林右心灌注,持续20min,结扎主气管,分离出气管、心、左肺,浸入10%中性缓冲甲醛溶液固定。2.
肺组织MMP2、Ⅳ型胶原的表达:免疫组化染色:4μm
石蜡切片常规脱蜡至水,MMP2、Ⅳ型胶原抗原修复,1%正常血清室温封闭20min,不洗,加适当稀释一抗,置4℃,18h,Envision试剂37℃,30min后,DAB+H2O2
显色,苏木素复染,盐酸乙醇蓝化,常规树脂封片。TBS 代替一抗作阴性对照。应用IMS细胞图象分析软件(上海申腾信息技术有限公司产品)由复旦大学附属医学院图象分析室专人图象分析胎鼠、4、10日龄鼠MMP2,4、10日龄鼠Ⅳ型胶原的分布及表达强度。显微镜处于恒定的电压和同一放大倍数(100倍),各组每一只大鼠的切片2~3张随机选取6个视野,避开气管、支气管分别测定其中阳性染色的积分光密度作为相对表达强度;同时测其阳性表达的面积和该视野肺实质组织的面积(除外肺空腔的面积),两者比值作为相对表达面积;得出免疫组化指数(相对表达强度×相对表达面积),求其均值,作为该大鼠的测定值,反映MMP2、Ⅳ型胶原表达的相对含量。3.肺组织MMP2mRNA的表达:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肺组织MMP2mRNA的表达。肺组织加Trizole,冰浴匀浆离心,经氯仿分层,异丙醇离心,酒精DEPC液洗涤,加DEPC水溶解稀释后测吸光度,逆转录成cDNA,产物4℃保存。MMP2引物序列:上游5′CACCATCGCCCATCATCA-3′,下游5′TGGATTCGAGAAAAGCGCAGC-3′,MMP2的PCR反应条件为:94℃预变性3min,94℃变性20s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环,72℃延伸5min。PCR产物278bp,凝胶电泳,拍照,图象分析系统处理软件测定电泳条带的积分吸光度(A 值),并以实验组和对照组目的基因与内参照(β-actin)的A值之比的变化(MMP2/β-actin)来衡量肺发育各个时期MMP2mRNA表达的相对变化。
三、统计学处理数据均用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数的比较用t检验。MMP2在气管、支气管上皮细胞,肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和一些间质细胞均有表达。各日龄DXM 组鼠肺MMP2的表达较对照组减少,两者
差异有统计学意义(表1、图1、2)。MMP2RT-PCR产物电泳结果显示:对照组从胎鼠始MMP2mRNA 的表达渐上调,4d最高,10、14d渐下调。DXM 组胎鼠、1、4、10日龄鼠肺表达均较对照组下调,以4日龄下调最明显,两组比较差异有统计学意义(表2)。肺组织切片Ⅳ型胶原免疫组化染色阳性呈棕黄或棕褐色,主要表达于肺上皮细胞、内皮细胞的BM。对照组4、10日龄鼠肺BM
的Ⅳ型胶原表达呈不连续线状,间有缺损,色较浅,表达量分别为16.98±2.72和17.21±2.29;DXM组鼠肺BM的Ⅳ型胶原表达较多、色较深、呈连续的线状,表达量、阳性强度明显上调,分别为23.19±3.69和20.30±2.29,相同日龄鼠两组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)(图3、4)。 四、相关分析
4日龄鼠肺组织MMP2mRNA 的表达和Ⅳ型胶原的表达之间存在负相关性(r=-0.608,P <0.05)。![]()
围产期肺泡发育以肺泡壁的变薄,次级隔的长出以及呼吸膜面积的成倍扩大为特征。次级隔的长出,壁的变薄,毛细血管的迅速长入形成网状结构,上皮细胞、内皮细胞、间质、间质细胞间的接触和相互作用等都关系到ECM的重建。BM 结构是ECM的特殊部分,Ⅳ型胶原是BM的主要成分[2],其氨基酸序列的N 端和C端与其他大分子相连接,形成一个纵横交错的菱形网状结构[4]。其在发育期的变化对细胞间相互作用,增殖、分化等至关重要。BM 的变薄、打开需Ⅳ型胶原等结构成分的代谢。胶原降解主要通过MMPs来实现,MMPs是一组锌离子依赖性蛋白水解酶家族,对ECM有广泛的降解作用,在机体组织正常的胚胎发生、器官形成、组织塑型、创伤修复的动态平衡中起着重要作用。现已发现19种5类,MMP2属明胶酶类,MMPs可由正常组织细胞和炎症及肿瘤细胞产生,其中明胶酶来源于成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞等。MMP2主要作用于Ⅳ型胶原,调节肺泡发育中BM的改变。发育中鼠的MMP2主要由间质细胞产生[5]。
我们观察到Ⅳ型胶原表达于肺的上皮细胞、内皮细胞的BM,新生4、10日龄鼠肺BM 的Ⅳ型胶原表达呈不连续线状,间有缺损,量较少,色较浅,正提示肺泡发育期BM 的Ⅳ型胶原在某种因素的作用下发生改变。MMP2是降解Ⅳ型胶原的特异性基质金属蛋白酶,本实验发现,在胎鼠、4、10日龄鼠的气管、支气管上皮细胞,肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和一些间质细胞均有表达,提示这些细胞来源的MMP2参与了肺发育。国外文献报道在肺发育各
期均见MMPs 及其相关因子的表达[5]。MMP2mRNA 的表达从胎鼠始渐上调,1、4日龄最高,10日龄逐渐下调。免疫组化示肺泡MMP2的表达也以4日龄时相对较强,MMP2在4日龄时形成的高峰,正与Ⅳ型胶原不连续线状,间有缺损,量较少,色较浅的表达时间相符,4日龄鼠MMP2mRNA
的表达和Ⅳ型胶原的表达之间存在负相关性,提示明显增加的MMP2可能参与上皮BM 的变薄和大量间质的消耗。此外,发育中细胞的增殖、迁移有赖于MMPs介导,Buckley等[6]报道体外培养的胎鼠肺泡上皮细胞迁移活性和培养液中MMP2、MMP9的含量均比成年肺高数倍,胎鼠肺泡上皮细胞培养加入外源MMP2可诱导胎鼠肺泡上皮细胞的迁移,均提示MMPs调控着肺发育中肺泡上皮细胞的迁移。肺泡上皮细胞的增殖、分化和迁移决定了肺泡化过程中大面积呼吸膜的形成[7]。同时ECM的降解会释放一些基质分子、生长因子、信号分子,这些分子对肺泡上皮细胞的增殖、分化具有调控作用[8]。某些ECM 成分暴露还能与生长因子等结合,使应答细胞能够接受生长因子的持续刺激,调节肺的发育[5]。发育肺的许多细胞如成纤维细胞、内皮细胞等均能分泌MMP2。由此可以推测MMP2在肺泡发育中起着重要的作用,在此过程中上皮细胞BM必须经降解使上皮细胞移动,与间质细胞交流,增殖,从而完成组织形态学上的发育,形成一巨大的肺泡表面,满足气体交换的需要。
本实验结果显示,产前在应用一定剂量DXM作用下4、10日龄鼠外周肺上皮细胞BM
的Ⅳ型胶原表达较对照组增多、色较深、较连续,线状,表达阳性强度明显上调,作为Ⅳ 型胶原代谢主要酶系的MMP2 发生了明显的改变:胎鼠、4、10
日龄鼠MMP2的表达较对照组明显下调,胎鼠、1、4、10日龄鼠MMP2mRNA 的表达较对照组明显下调,尤其4日龄鼠下调最显著,4
日龄鼠肺组织MMP2mRNA的表达与Ⅳ型胶原的表达之间存在负相关性,提示表达下调的MMP2使Ⅳ型胶原的降解减少,阻碍BM
的变薄、裂开和细胞的分化、复制、交流,肺泡间隔变薄。同时糖皮质激素也减弱了MMPs介导发育中肺泡上皮细胞迁移、增殖的作用,Ⅱ型肺泡上皮细胞的增殖以及向Ⅰ型细胞转化受抑制,导致Ⅰ型细胞减少。在4~13日龄鼠用DXM 的实验中发现DXM抑制成纤维细胞增殖比抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞分化更快,成纤维细胞减少,干扰上皮细胞与基质细胞间的不平衡状态,抑制肺泡正常的隔化[9]。糖皮质激素可在转录水平下调发育肺MMP2基因的表达[4],使MMP2的合成减少。至14日龄两组MMP2mRNA的表达差异不明显,推测与产前糖皮质激素治疗作用相隔时间较长,以及正常14日龄鼠MMP2mRNA的表达下降有关。
肺泡发育是肺发育的重要阶段,关系到生后甚至成年后的肺形态及功能,本研究认为孕后期使用地塞米松,会抑制新生鼠肺组织MMP2的表达,使Ⅳ型胶原的降解减少,阻碍BM的变薄、裂开及细胞的分化、复制、交流,使肺泡间隔变薄,从而影响肺泡发育。
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