温故知新｜SHP基因与新生儿出生体重关系的探讨
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2024-11-08 17:03
北京
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引用格式：韩红敬,魏丽惠,王山米,等. SHP基因与新生儿出生体重关系的探讨[J]. 中华围产医学杂志,2005,8(05)：326-330. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2005.05.015作者单位:100044 北京大学人民医院产科(韩红敬、魏丽惠、王山米),内分泌科(纪立农)目的 评价微小异源二聚体伙伴基因(small heterodimer partner gene,SHP)基因与新生儿出生体重的关系。方法 应用队列研究的方法,收集191例无妊娠合并症及并发症的母血及新生儿脐血标本,利用PCR-RFLP的方法研究SHP基因的单核苷酸多态性,(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs7504的基因多态性。 结果 (1)随出生体重的增加新生儿携带C等位基因和TC+CC基因型频率增加,且有统计学差异(P=0.004;P=0.005);孕妇C等位基因和TC+CC基因型频率亦随新生儿出生体重增加而增加,有统计学差异(P=0.013,P=0.013)。(2)此位点携带C等位基因者新生儿体重增加,携带TC+CC基因型的新生儿比携带TT基因型的新生儿体重平均增加246.3g[(3658.7±400.9)g和(3412.4±444.4)g,P=0.005)]。同时孕妇携带C等位基因者其分娩新生儿体重比不携带C等位基因孕妇分娩的新生儿体重平均增加210.3g[(3418.6±449.0)g和(3628.9±405.5)g,P=0.011)]。(3)比较脐血TC+CC基因型与TT 基因型的临床参数,发现SHP基因与血糖和胰岛素不相关;与母亲的体重、孕前BMI、父亲的身高、体重相关。孕妇携带TC+CC基因型者体重和孕前BMI略有增加,但无统计学差异;且与血糖和胰岛素水平无明显相关。(4)多因素分析结果表明孕妇身高、孕期增重、孕前BMI、分娩孕周、脐血胰岛素、母血胰岛素水平均与新生儿体重相关,调整以上因素之后,脐血SHP基因仍与新生儿体重显著相关(P=0.0354),母血SHP基因与新生儿体重无明显相(P>0.05)。 结论 SHP基因与新生儿出生体重相关,在胎儿宫内发育中起一定的作用。
【关键词】微小异源二聚体伙伴基因;出生体重;胚胎和胎儿发育;多态现象(遗传学)研究发现许多成年期疾病起源于胎儿期,低出生体重与成年后的胰岛素抵抗、糖尿病、心脏病、高血压等有关,同时巨大胎儿成年后肥胖和糖尿病发生几率也增加。因而对胎儿生长发育的相关研究日益受到医学界的重视。胎儿宫内发育受多种因素的影响,是环境因素还是遗传因素起关键作用说法不一。 微小异源二聚体伙伴基因(small heterodimer partner gene,SHP)编码的蛋白产物是核受体超家族的成员之一,与其他多种激素受体相作用,抑制其转录活性,包括类维生素A受体、甲状腺激素受体、雌激素受体、雄激素受体、肾上腺皮质激素受体、肝细胞核因子受体等,同时能增强过氧化物酶体增强激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)的转录活性,参与胆固醇代谢。2001年Nishigori等[1]研究发现SHP基因与日本人轻中度肥胖及出生体重增加有关,提示SHP基因可能参与胎儿宫内发育的调节。本研究通过队列研究的方法,应用PCR-RFLP分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因的SNP位点rs7504,评价SHP基因与新生儿体重的关系。 选择2001年12月至2002年12月在我院住院分娩,年龄<35岁的足月、单胎、初产妇共191例,无妊娠糖尿病、中重度妊高征、中重度贫血等严重的合并症。 1. 临床资料登记,问卷调查内容包括:(1)孕妇的年龄、民族、职业、文化程度、家族史;身高、体重、孕前体重、孕期增重、出生体重;(2)早孕反应时间及程度、孕中晚期饮食情况(主食增加量、水果、牛奶、鸡蛋、肉日摄入量)、有无被动吸烟、孕期50g糖筛查数值(如糖筛值异常注明75g糖耐量值)、妊娠并发症;(3)丈夫的年龄、民族、文化程度、家族史、身高、体重、出生体重;(4)分娩孕周、分娩方式;(5)新生儿出生体重、身长、性别、Apgar评分。2. 标本收集及测定:分别于分娩时或剖宫产时留取产妇静脉血及脐血各10ml,其中5ml加入含抗凝剂(2%EDTA)的试管内,冻存于-20℃冰箱内待用于提取DNA,另5ml于取血后2h内离心(3000rpm,15min),提取血清冻存于-20℃冰箱内,待测血糖及胰岛素。采用放射免疫方法测定胰岛素,葡萄糖氧化酶方法测定葡萄糖。共留取191例脐血DNA 标本,185例母血DNA 标本(6例母血DNA 在提取过程中丢失)。 4. 聚合酶链式反应(PCR扩增):引物设计:由赛百盛生物工程公司合成。上游:5′-GGACCTCTTCTTTCGCCCTATC-3′ 下游:5′-TGGTCCAATAAGCAGCCTAAGC-3′。PCR条件:15μl反应体系,含模板DNA50~100ng,上下游引物各7.5pmol,dNTP200μM,1.5 mM MgCl2,TaqDNA 聚合酶0.5μl(2.5U/μl),三蒸水补至终体积。94℃预变性5 min后进入PCR循环:94℃ 变性1min,63℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环。72℃终延伸5min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR特异扩增产物。 5. 限制性片断多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP):酶切反应体系:10μl反应体系含内切酶BsiHKA-I4.2U,内切酶缓冲液、BSA(胎牛血清),PCR 产物5μl,65℃水浴16h。2.5%琼脂糖凝胶电泳,100V,25min,紫外灯下读取基因型。共发现3种SHP基因型:TT、TC、CC,BsiHKAI的酶切位点5′-GWGCW↓C-3′,经酶切后,TT不能被切开,呈一条带(363bp),CC被识别切开后,呈2条带(101bp,262bp),TC则部分被识别,呈3条带(101bp,262bp,363bp)。 6.DNA 测序分析:对于SHP的不同基因型的PCR产物进行测序分析,用3700测序仪(美国ABI公司生产)进行测序。测序过程在国家人类基因组基因中心诺赛基因测序部进行。 全部数据输入SPSS10.0for Windows,进行χ2相关分析或Pearson检验,数值型变量均经正态检验,其中脐血、母血胰岛素呈偏态分布,经自然对数转化后呈正态分布。利用SAS统计软件包,采用广义线性模型方法进行多因素分析。 新生儿脐血总例数191例。新生儿出生体重符合正态分布,其四分位数由小到大依次为3141.3g,3443.3g,3680.0g。最小值:2520g,最大值为4670g,均数为(3451.1±446.0)g。 按出生体重四分位数进行分组,共分4组:第一组:2520.0~3141.3g,48例;第二组:~3443.3g,48例;第三组:~3680.0g,47例;第四组:~4670.0g,48例。 母血总例数185例,按以上标准分组后第一组44例,第二组47例,第三组47例,第四组47例。
二、各临床参数与新生儿出生体重的关系 Pearson相关分析结果提示:孕妇的身高、孕前体重、孕前BMI、孕后期体重、孕期增重、分娩孕周、新生儿身长以及脐血胰岛素水平均与新生儿体重呈显著正相关(P<0.05)。母血胰岛素水平与新生儿体重呈显著负相关(P<0.05)。孕妇的年龄、孕中期血糖筛查值、分娩时母亲的血糖、脐血血糖以及丈夫的年龄、身高、体重与新生儿体重均无相关性(P>0.05)。 孕妇的民族、职业、文化、家族史以及丈夫的民族、文化、家族史及孕期状况等四组间比较无统计学差异(P>0.05)。
三、SHP基因与新生儿体重的关系 1. 脐血SHP基因与新生体重的关系:(1)脐血SHP基因分布:计算各基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律。比较脐血SHP基因在四组中的分布,发现随出生体重的增加,含TC或CC的基因型增加,且差异有统计学意义(将TC、CC合并后计算χ2=9.433,P=0.024);等位基因C频率随着出生体重增加出现频率增加,且有显著差异(χ2 =9.726,P=0.021),见表1。以本组出生体重中位数3443g为界,分为两组,基因型及等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=7.926,P=0.005;χ2=8.071,P=0.004)。(2)不同脐血SHP基因型各临床参数比较:携带TC或CC的基因型比TT基因型的新生儿出生体重增加246.3g(3658.7±400.9)g和(3412.4±444.4)g,t=-2.827,P=0.005)。
2. 母血SHP基因与新生儿体重的关系:(1)母亲SHP基因分布:分别计算各基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。比较母亲SHP基因在四组中的分布,发现随新生儿出生体重的增加,含TC 或CC 的基因型增加,但无显著差异(见表2)。以本组出生体重中位数3443g为界,分为两组,基因型及基因频率分布有显著差异。(2)比较不同母血SHP基因各临床参数:携带C 等位基因的孕妇比不携带者其新生儿体重明显增加,平均增加210.3g (3418.6±449.0)g和(3628.9±405.5)g(t=-2.568,P=0.011)。 携带TC或CC基因型的孕妇与TT 基因型的孕妇相比,孕晚期体重(71.6±9.7和74.9±9.4,t=-1.84,P=0.067)、孕前BMI(20.6±2.8和21.5±3.0,t=-1.810,P=0.072)略有增加,但无统计学意义。孕期增重及孕妇本人出生体重两组无统计学意义(P>0.05);两组间分娩时的母血血糖、胰岛素和脐血血糖、胰岛素无差异(P>0.05)。 采用广义线性模型方法,将以上单因素分析与新生儿体重相关的因素进行综合分析,结果发现,孕妇身高、孕期增重、孕前BMI、分娩孕周、脐血胰岛素、母血胰岛素与新生儿体重相关。经多因素分析,调整以上因素之后,脐血SHP基因仍与新生儿体重相关(P<0.05),见表3。而母血SHP基因经多因素分析后,则未显示与新生儿体重明显相关(P>0.05)。 核受体超家族(nuclear receptor superfamily)是一组转录因子,受微小的疏水激素如:类维生素A、甲状腺激素、类固醇激素等调节。这个超家族还包括大量尚无已知配体的相关蛋白,即孤立核受体。SHP基因产物作为核受体超家族的成员之一,与其他多种激素受体相作用,抑制其转录活性,包括类维生素A 受体、甲状腺激素受体[2]、雌激素受体[3]、雄激素受体[4]、肾上腺皮质激素受体、肝细胞核因子受体[5]等,同时能增强PPAR 的转录活性[6],参与胆固醇代谢[7]。 1996年Seol等[2]应用酵母二代杂交系克隆了小鼠肝脏编码NROB2的cDNA 序列,并因其长度微小,能与其他家族成员相作用,命名为微小异源二聚体伙伴基因。SHP蛋白由256氨基酸组成,含有其他核激素受体超家族成员中所有的配基结合和二聚体形成的结构域,但缺乏传统的DNA 结合位点。1998年Lee等[8]分离出人类的NROB2的基因组序列。并进行结构分析表明SHP包含2个外显子,中间含有大约1.8kb的内含子(鼠类内含子1.2kb),跨越大约2kb。NorthernBlot杂交分析显示在成人的小肠、脾脏、卵巢、睾丸、胎儿肝脏、胎儿肾上腺均有NROB2的表达。通过SouthernBlot杂交和FISH 的方法将其定位于1p36.1染色体。 基因组的信息横向变化大多是序列上的单个核苷酸有所不同,称之为单核苷酸多态性,与第二代基因图谱的微卫星等串连重复序列相比,SNP是一个具有高度稳定性的遗传学标记。在两个个体之间人类染色体上每1000个碱基中,平均就有一个核苷酸位点有不同。这种位点多态性是指至少人类有两种变异。人类有大量多态性与疾病易感性和毒物易感性有关。 基因组的信息横向变化大多是序列上的单个核苷酸有所不同,称之为单核苷酸多态性,与第二代基因图谱的微卫星等串连重复序列相比,SNP是一个具有高度稳定性的遗传学标记。在两个个体之间人类染色体上每1000个碱基中,平均就有一个核苷酸位点有不同。这种位点多态性是指至少人类有两种变异。人类有大量多态性与疾病易感性和毒物易感性有关。 通过查询Internet获知SHP基因有一个SNP位点,即rs7504,位于SHP基因第二外显子的5′非翻译区,通过对20个染色体进行分析估计平均杂和度为0.427,平均等位基因频率A/T:0.309,G/C:0.691。本研究对191例新生儿DNA 的分析发现T的频率为0.919;C的频率为0.081。185例孕妇分析表明T的频率为0.9;C的频率为0.1。提示,中国人SHP基因的SNP 多态性与白种人明显不同,可能存在种族差异。 通过查询Internet获知SHP基因有一个SNP位点,即rs7504,位于SHP基因第二外显子的5′非翻译区,通过对20个染色体进行分析估计平均杂和度为0.427,平均等位基因频率A/T:0.309,G/C:0.691。本研究对191例新生儿DNA 的分析发现T的频率为0.919;C的频率为0.081。185例孕妇分析表明T的频率为0.9;C的频率为0.1。提示,中国人SHP基因的SNP 多态性与白种人明显不同,可能存在种族差异。 2001年Nishigori等[1]研究173个早发糖尿病患者分析后发现SHP突变与肥胖更相关,而与糖尿病无关;在另外101例不相关非糖尿病的早发肥胖者的研究中,发现6例突变,在116例非糖尿病的瘦人对照中则未发现突变(P=0.0094)。同时在糖尿病家族中,比较有SHP突变与无SHP突变者的出生体重有显著差异[各8例,出生体重(2707.1±299.7)g和(3899.6±228.9)g,P=0.0082],考虑到家族中许多遗传和环境因素相似,因而更能提示SHP突变与出生体重有关。 本研究通过队列研究的方法,应用PCR-RFLP的方法,分析SHP 基因的SNP 位点rs7504,评价SHP基因与新生儿体重的关系。结果表明SHP基因与出生体重相关。新生儿携带C 等位基因比不携带C者出生体重增加。等位基因C的频率随生体重的增加出现频率增加。母体携带C 等位基因比不携带者新生儿出生体重增加。 本研究通过多因素分析表明,孕妇身高、孕期增重、孕前BMI、分娩孕周、脐血胰岛素、母血胰岛素均与新生儿体重相关。同时调整以上因素之后,脐血SHP基因仍与新生儿体重相关;母血SHP基因与新生儿体重无明显相关。提示SHP基因与新生儿体重相关,在中国的胎儿宫内发育调节方面可能起一定的作用。 Nishigori等[1] 进行功能研究发现,在肝脏HepG2 细胞和产生胰岛素的MIN6-m9 细胞,HNF-4а能有效增强由HNF-1а启动子转录激活的报告基因的活性。野生型SHP 蛋白能显著抑制HNF-4а的活性,而突变SHP 蛋白(H53fsde110, L98fsde19insAC, R34X, A195S, R213C)的抑制功能则显著下降。SHP基因突变导致其抑制HNF-4а转录活性的功能下降,从而HNF-4а的活性增强,导致胰岛素分泌增加。胎儿胰岛素增加致使胎儿生长加速,出生体重增加,为日后肥胖奠定基础。
Nishigori等[1]的研究同时发现SHP基因突变不伴有下丘脑和垂体激素等内分泌的变化,这种不依赖于下丘脑的途径可能与SHP作用于多种与代谢相关的核受体有关,包括类固醇激素、类维生素A激素、甲状腺激素受体、HNF-4а受体、尤其是在脂肪合成中起重要作用的PPARs,但机制不明。 目前尚无研究SHP基因SNP位点rs7504T/C变异对其功能的影响。本研究中未能发现SHP基因与胰岛素分泌的关系,提示其影响出生体重的机制可能不是通过胰岛素起作用,而是存在其他的机制,尚待进一步研究阐明。 总之,胎儿宫内发育受多种因素调节,是遗传和环境因素共同作用的结果。孕妇身高、孕期增重、孕前BMI、分娩孕周、脐血胰岛素、母血胰岛素均与新生儿体重相关。SHP基因与新生儿出生体重有关,等位基因C与出生体重增加有关。提示SHP基因可能参与胎儿宫内发育的调节,其调节机制尚待阐明。 总之,胎儿宫内发育受多种因素调节,是遗传和环境因素共同作用的结果。孕妇身高、孕期增重、孕前BMI、分娩孕周、脐血胰岛素、母血胰岛素均与新生儿体重相关。SHP基因与新生儿出生体重有关,等位基因C与出生体重增加有关。提示SHP基因可能参与胎儿宫内发育的调节,其调节机制尚待阐明![]()
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