1 灵感来源

    从20世纪90年代初至今，全世界有80多个国家栽培柑橘，目前柑橘已经成为世界第一大水果，年贸易额达到65亿美元，仅次于小麦和玉米, 为第三大国际贸易农产品。柑橘因为其中富含的维生素C、叶酸、类胡萝卜素、纤维素、及矿物质具有很高的营养价值、药用价值及保健价值,被国内外公认为保健食品。而柑橘汁也因其色泽鲜亮、营养丰富、口味与香气宜人,成为世界上最受欢迎、贸易量最大的果汁产品之一,大约占据了2/3的世界果汁市场。在过去几十年，在柑橘类农作物培育方面的研究大多集中在产量，抗病、抗虫、抗逆等方面，而品质改良的目标主要在于控制其糖酸比以及改善质地和耐储藏性方面。

实际生活中，我们发现所饮用的柑橘类果汁会因为加工方式的不同而产生较大的风味差异并且在长期贮藏和热处理过程中会产生令人难以接受的苦味，这种苦味大大影响了消费者饮用果汁时的口感。近年来，国内外对柑橘的研究主要集中于对不同产地、不同品种的香气化学组分的定性定量分析，香气物质组分差异以及找寻其中关键的特征风味物质和水果类香气协同，而对柑橘中主要致香物质的生物合成途径的实质以及在合成过程中相关酶的生理功能及发挥的作用和水果在储藏、加工过程中香气物质的变化的机理研究的较少。

1.1不同的加工方式对柑橘类果汁风味的影响

按照果汁加工方式的不同, 将其分为冷冻浓缩型、浓缩还原型(FC)以及非浓缩还原型(NFC)3种产品形式。冷冻浓缩型果汁一直是世界贸易的主要产品, 它具有易于保存、贮运的优点, 但其加工过程复杂, 果汁中的风味物质和营养成分损失较多。浓缩还原型橙汁是将冷冻浓缩果汁稀释或调配后的产品,其优点是方便消费者饮用。非浓缩还原型橙汁即巴氏灭菌后进行无菌包装或无菌储藏的原果汁^[1]。研究分别对三种不同加工方式的柑橘果汁的风味挥发物进行鉴定，发现一直被视为橙汁香气减弱标志的α-萜烯醇在冷冻浓缩型和FC果汁中均检测到。另外, 香芹醇、香芹酮是柠檬烯在酸性环境下的氧化产物, 与生产中的加热过程有关^[4], 而在研究中的所有样品中均有检出, 这可能与测定过程中的受热有关。

1.2柚皮苷等苦味物质对柑橘类果汁风味的影响

柑橘果汁的苦味来自两个方面，其一是柚皮苷的作用；其二是柠檬苦素类似物的作用。柚皮苷是一类黄酮类化合物，带有强烈的苦味，在水中的苦味阈值为^[5]。据报道，柚皮苷的溶解度随含糖量的增加而升高，但溶解度又随pH值得升高而降低。

柠檬苦素类似物广泛存在于柑橘属植物中，至今已从柑橘属植物分离出36种柠檬苦素类似物及17种柠檬苦素类似物配糖体。引起柑橘类果汁中苦味的主要成分是柠碱^[6]。据报道，柠碱在水溶液中的苦味阈值约为^[5]。有强烈苦味的柠檬苦素和诺米林酸如果在柑橘果汁中的含量超过6mg/L，那么这种柑橘就不适合用于饮食业^[7]。研究还表明，柠檬苦素类似物的后苦味现象会由于柑橘中存在的柠檬苦素D环内酯水解酶而得以加强。

1.3研究的目的及意义

我们主要想通过对柑橘类水果中主要致香物质的生物合成途径以及在合成过程中相关酶的生理功能及发挥的重要作用的研究，对萜类合成酶基因家族进行分离鉴定以及建立文库，利用代谢工程人工改良柑橘类水果的风味以及对抑制苦味素的脱苦酶基因进行分离鉴定，植入植物体内，抑制或减少苦味素的形成，进而改善柑橘类水果的香气和口感。

2 目前的研究进展

2.1柑橘类果汁中的关键风味物质

    我们选用来自全球十个不同产地的柑橘，去除果核，将整个柑橘挤压成汁。在提取出来的10g果汁中加入2g NaCl进行破乳，再加入202-辛醇作为内标物，将它们置于15ml封闭的固相微萃取瓶中，摇匀。使用购自Supelco Inc.（Bellefonte，PA，USA）的65μm聚二甲基硅氧烷 - 二乙烯基苯（PDMS / DVB）萃取纤维头进行香气的萃取吸附，最后进入GC-MS对其进行定性定量的分析。利用嗅觉活力值的计算公式，通过OAV=C/T，计算出各香韵分路的代表性风味物质的OAV值。通常认为，具有较高OAV的芳香活性化合物最有可能成为总体香气的主要贡献者，对于给定的挥发性化合物，OAV>1表示该化合物对柑橘香气有直接影响。

表2-1 十个不同产地柑橘果汁中香气物质的平均OAV值

从表2-1可知，我们发现共有11种香气组分的OAV>1,其中柠檬烯的含量和OAV值都是最高的，而含量比柠檬烯低10倍多的丁酸乙酯和对伞花烃的OAV值也相对较高。不可否认，柠檬烯是甜橙的主要香气成分，主要提供柑橘状或柠檬样香气。乙醛，2-甲基丁酸乙酯，芳樟醇，癸醛虽然相较而言含量低，但其OAV值较高，说明对甜橙果汁的香气贡献较大，值得我们关注。基于上述信息，我们可以得出结论，乙醛，己醛，丁酸乙酯，己酸乙酯，柠檬烯，甲位-松油烯，乙位-水芹烯，伞花烃，甲位-异松油烯，对伞花烃，乙位-月桂烯，癸醛，瓦伦西亚橘烯对柑橘类的香气有主要贡献。而其中，单萜类物质所占的比重较大，所以在柑橘类果汁的风味中，萜烯类物质发挥了很大的作用。

           d-柠檬烯                     α-松油烯                        对伞花烃

           β-月桂烯                                      瓦伦西亚橘烯

2.2 合成柑橘类果汁关键风味物质的生物途径

萜类化合物是柑橘类水果挥发出的香味物质中的代表性组分，是以异戊二烯  （C5H8）n结构为基本单元的烃类及其含氧衍生物。萜类化合物由C5单位异戊烯焦磷酸（IPP）和它的丙烯基异构体二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）缩合而成。植物体中IPP和DMAPP的合成途径及合成部位并不相同，一条是位于细胞质的MVA途径，另一条是位于质体的MEP途径，这两条途径所涉及到的基因和酶也相去甚远^[9]。

异戊烯焦磷酸（IPP）

2.2.1 MVA途径及相关酶

MVA途径一直以来都被认为是萜类化合物生物合成的唯一途径^[10]。由Bloch和Lynen于1985年首先在动物和酵母中发现，它主要存在于细胞质中，因此又被称为细胞质途径。

在MVA途径中，两个乙酰辅酶A（AcetylCoA）在乙酰乙酰辅酶A转移酶（AACT）的催化下缩合成乙酰乙酰辅酶A（AcetoacetylCoA），此反应需要Fe²⁺和质体醌的辅助^[9]；生成的乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS）的催化下缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）；之后，HMG-CoA还原酶（HMGR）催化HMG-CoA形成具有6个碳原子的中间体甲羟戊酸（MVA），此过程不可逆。所以HMGR被认为是重要的限速酶，对后期倍半萜，三萜等物质的产量有较大的影响。

2.2.2 MEP途径及相关酶

2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径是在MVA途径被发现之后的另一条途径，该途径发生于质体当中，故又称为质体途径，这条途径是近几年新发现不久的。目前，MEP途径已被发现于植物质体、藻类、蓝藻、真细菌、及顶复门寄生虫等物种中，而在古细菌、真菌和动物中不存在MEP途径^[11]。

MEP途径以3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸为起始物，由DXS合酶催化合成5-磷酸脱氧木酮糖（DXP），在DXP还原异构酶（DXR）催化下，DXP被转变成 2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP），此步反应是DXP途径上最重要的限速反应，也是萜类物质代谢工程最重要的靶点，因而被称为MEP途径。MEP再经过缩合、磷酸化、还原、脱水等步骤形成重要中间产物IPP和DMAPP，进而合成单萜，四萜及类胡萝卜素等，是需要我们重点研究的一条途径。

IPP和其异构体DMAPP在异戊烯基焦磷酸异构酶IPI的作用下可以相互转化；IPP和DMAPP经头尾缩合生成具C10骨架的牻牛儿基焦磷酸（GPP）；GPP经烯丙基转移酶催化加上第2个IPP单元形成具C15骨架的法尼基焦磷酸（FPP）；FPP经烯丙基转移酶催化再加上第3个IPP单元形成具C20骨架的牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。IPP、GPP、FPP和GGPP作为萜类合成的中间体，在一系列酶的作用下形成相应的单萜、倍半萜和二萜等不同碳原子数的类异戊二烯化合物。

2.3 柑橘类果汁脱苦技术研究

有大量证据表明柑橘类水果在长期贮藏和热处理过程中会产生令人难以接受的苦味，这种后苦味即延迟苦味现象给柑橘制品带来了很大影响，并严重制约着柑橘加工业的发展^[4]。柚皮苷和柠檬苦素类似物是最主要的两大苦味物质。目前已知的抑制柑橘类水果中苦味物质的方法有：吸附脱苦法、添加苦味抑制剂、改善榨汁方法、代谢法、膜分离技术、超临界CO2脱苦、基因工程脱苦及酶脱苦法等多种方法^[12]。

酶法脱苦主要是利用不同的酶分别作用于柠碱和柚皮苷，使之生成不含苦味的物质。酶法脱苦可分为自然酶法及固定化酶法，其中，固定化酶具有比自然酶更广泛的pH值和温度适应范围，且能多次使用。脱苦酶按作用对象可分为黄烷酮糖苷类化合物脱苦酶和柠檬苦素(柠碱)类化合物脱苦酶。作用于黄烷酮糖苷类化合物的脱苦酶主要是柚皮苷酶，由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成。柚皮苷在此酶的作用下最终生成没有苦味的桔皮素和葡萄糖。王鸿飞等人的实验表明用柚皮苷酶对柑橘类果汁进行脱苦具有良好的效果，脱苦率达90.55%^[12]；柠檬苦素类脱苦酶最适宜的pH值都偏向碱性，直接将其用于脱苦时需调节柑橘汁的pH，这会影响柑橘汁的品质，而柚皮苷酶的最适宜pH值与柑橘汁的自然pH值相接近，因此，在用固定化酶对柑橘汁进行脱苦时使用最多的是柚皮苷酶^[13]

3 具体的应用方案

3.1 通过酶基因调控萜类风味化合物的代谢

从目前的研究进展中，我们发现单萜类物质主要通过MEP(质体)途径生成，MEP途径是近几年来新发现的一条途径，其中IPP和DMAPP是类萜代谢途径的起始物，也是所有萜类化合物合成的前体，提高它们在细胞中的水平是提高萜类产物合成的关键。而合成路径上的DXS和DXR都是重要的限速酶，Mandel等^[8]已经从拟南芥中分离鉴定了编码DXS的CLA1基因；研究人员从薄荷中分离到DXR基因，并将DXR基因连接CaMV35S启动子转移到薄荷中，大多数转基因植株的薄荷精油(多为单萜化合物)含量与对照相比显著提高，最高增幅可达 5 0 % ，而精油的化学组成没有明显改变^[14]。我们可以分别从产量较大的萜烯类植物体内将DXS，DXR和异戊二烯转移酶的基因转移到拟南芥中进行表达，观察植物中各种类异戊二烯产物的积累。目前MEP途径中的其他一些酶，如CMS、CMK和MCS，它们的基因已经得到克隆^[15]，但他们具体的表达特性还未可知，其代谢调控机制需要更加深入的探究。类萜形成过程中多种酶对萜类合成起着调节作用，只增加一个关键酶基因在细胞内的拷贝数来提高目的产物的产量是有限的，我们可以考虑对几个重要的限速酶进行多基因转移，从中筛选出高表达的工程植株。

3.2 通过酶基因减少或抑制苦味物质的生成

    脱苦酶（柚皮苷酶）是由α-L- 鼠李糖苷酶和 β-D- 葡萄糖苷酶两种酶组成的混合酶制剂，在使用中有可能因为某一种酶的失活而是整个脱苦酶丧失活性。据研究，α-L-鼠李糖苷酶和 β-D- 葡萄糖苷酶对底物的水解速度并不相同，前者比后者具有更高的水解速度^[3]。我们想将脱苦酶（柚皮苷酶）中的两个酶进行分离，将编码脱苦酶的基因克隆并导入到柑橘细胞中表达，在不影响果汁品质的前提下以达到自然脱苦的目的。我们希望通过基因工程脱苦技术实现可改良品种，从根本上解决柚皮苷和柠檬苦素的苦味问题。

参考文献

[1]牛丽影，吴继红，廖小军,陈芳,赵广华,胡小松.不同类型橙汁挥发性风味成分的测定与比较[J].中国食品学报,2008,(01):119-124.[2017-09-24].DOI：10.16429/j.1009-7848.2008.01.007

[2]李和生,王鸿飞,周石磊,励迪平.柑橘类果汁中柚皮苷的分析[J].农业机械学报,2006,(04):76-79+90.[2017-09-24].

[3]刘永安,刘欣,魏法山,李娜,李栓栓,李存良.柑橘类果汁脱苦技术研究进展[J].食品安全导刊,2015,(27):137-138.[2017-09-24].DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2015.27.086

[4]李于善, 贺艳, 邓静, 等. 柑橘香精油的提取及提高其香气品质的研究[J] . 食品与发酵工业, 2004, 30 ( 11) :51～54.

[5]JohnsonR L,Chandler B V.Adsorptive removal of bitter principles and tritratables andtritratable acid from citrus Juices[J].Food Technology,1988,42(5):130-137

[6]MitchellD H,Pearce R M.Removal of bitter naringin and limonin from citrus juicescontaining the same [P].U S.Patent:4514427,1985.

[7]Ribeiromhl,Silveirad,Ferreiradiass.Swlectiveadsorption of limonin and naringinfromorange juice to natural abdayntheticadsorbents[J].European Food Research and Technology,2002.215(6):462-471

[8]Mandel MA et al. Plant J, 1996, 9: 649

[9]孙晋. 番茄萜类化合物生物合成途径相关酶基因的克隆与分析[D].华中农业大学,2008.

[10]刘丽. 利用抑制剂对人参皂苷生物合成途径MVA与MEP的研究[D].吉林大学,2012.

[11]查良平,袁媛,黄璐琦,余淑琳. 厚朴MVA途径相关基因鉴定及生物信息学分析[J]. 中国中药杂志,2015,40(11):2077-2083..

[12]许少丹,谢婧.柑橘类果汁脱苦技术研究进展[J].饮料工业,2012,15(06):15-19.

[13]潘利华,徐迪,布文婕.柑橘类果汁脱苦的研究进展[J].饮料工业,2006,(02):6-9.

[14]Mahmoud SS et al. Proc Natl AcadSciUSA, 2001, 98: 8915

[15]DubeyVS et al. J Biosci, 2003, 28: 637