Tom带你回归童年——快速生长克隆感受态Turbo

文摘   2024-10-31 09:24   北京  














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操作步骤(均适用于Turbo、Mach1-T1、DH5α感受态)


A  常规转化流程

1. 感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25 min。

注意:所使用DNA体积不要超过感受态细胞体积的1/10,100 μL感受态细胞能够被 1 ng超螺旋质粒DNA所饱和。

2. 42℃水浴热激45 s,迅速放回冰中并静置2 min,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μL不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60 min。

4. 5000 rpm离心1 min收菌,留取100 μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。



B  快速转化流程(一)

1. 提前15 min将培养基平板37℃预热。

2. -80℃取出感受态冰浴,加入目的基因,轻轻拨打管底混匀,冰上静置≥5 min。

3. 将管中所有的感受态-DNA混合物转移到预热的培养基平板,用玻璃珠或涂布棒涂布均匀。

4. 将平板倒置于37℃培养箱过夜培养。

(该快转方法一的转化效率约为正常转化流程的20%-30%,pUC19的转化效率≥ 2*109 cfu/μg)


C  快速转化流程(二)

1. -80℃取出感受态冰浴,加入目的基因,轻轻拨打管底混匀,冰上静置5 min。

2. 42℃水浴热激45 s-60 s,迅速转移至冰浴中静置2 min。

3. 将管中所有的感受态-DNA混合物转移到预热的培养基平板,用玻璃珠或涂布棒涂布均匀。

4. 将平板倒置于37℃培养箱过夜培养。

(该快转方法二的转化效率约为正常转化流程的30%-40%,pUC19的转化效率≥ 3*109 cfu/μg)


我们下期见!



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