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蛋白-DNA互作利器之
EMSA实验
凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种定性或定量分析蛋白-核酸相互作用的方法。最初用于研究转录因子与启动子的相互作用，目前同样应用于RNA结合蛋白与RNA的互作研究。EMSA实验能够检测核酸的电泳迁移速率。核酸可以被放射性同位素、共价/非共价荧光基团或生物素标记，进而能够通过放射自显影、荧光成像、化学发光成像分别进行检测。因生物素标记安全可靠无污染，可避免同位素对人与环境造成影响，在科研中广泛被应用。
一 实验原理
EMSA技术基于蛋白质-核酸复合物与核酸探针在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先蛋白质与末端标记的核酸探针结合，再进行PAGE电泳。电泳过程中蛋白质-核酸复合物迁移速率较慢，而游离核酸速率较快，因此从后续显影结果就可以判断目的蛋白是否结合特定核酸序列。
图1 EMSA原理图
二 实验流程
目的蛋白表达纯化——探针合成与标记——蛋白与探针孵育——PAGE电泳——转膜——紫外交联——显影。
图2 EMSA实验流程
三 产品介绍
为了快速简便的进行EMSA实验，Coolaber推出了化学发光法EMSA试剂盒。本试剂盒中的试剂添加了有效成分，可以促进DNA与蛋白质的特异性结合，并且在孵育洗膜过程中，能有效去除背景信号，同时使蛋白质-DNA复合物的条带信号更清晰。
产品内容：
产品特点：
本试剂盒提供了EMSA检测所需的结合缓冲液和上样缓冲液，及一些关键的相关试剂，可以实现非同位素的EMSA检测。可以用于100个蛋白和探针的结合反应，并足够检测至少10块以上有生物素标记EMSA探针的膜。
产品优势：
1)安全环保：采用生物素对核酸进行标记，避免放射性同位素对人类及环境的污染，安全性高、适用范围广。
2)灵敏度高：探针检测灵敏度高，背景较低。
3)简单快捷：整个实验流程周期短，3-4小时内即可完成检测。
EMSA实验结果解读：
EMSA实验通常至少包含3组反应来验证目的蛋白与核酸之间是否存在相互作用：
图3 EMSA样品设置图
（1）第1组阴性对照反应：反应体系中仅含有标记探针，理论上探针的位置应该位于膜的最下方；
（2）第2组常规反应：反应体系中加入了目的蛋白与标记探针，理论上游离探针位置位于膜的下方，蛋白与标记探针复合物的滞留带在探针位置的上方；
（3）第3组竞争反应：反应体系中加入了目的蛋白、标记探针以及100倍量的未标记的探针。先用未标记的探针和蛋白孵育，通常探针都是过量的，理论上目的蛋白全部会与未标记探针结合，再加入标记的探针后，没有多余目的蛋白与之结合，则产生的结果为蛋白与非标记探针复合物的滞留带不能显影出现条带，而标记的探针位于膜下方。
四 常见问题解析
1. 为什么背景过高？
1） 曝光和成像时间过长；
2） 封闭时间短或者效率低；
3） 洗涤效果差；
4） 实验过程中膜没有一直处于浸润状态；
5） 转膜过程中工具或者膜被污染；
6） 发生非特异性结合；
7） 探针浓度过高；
2. 为什么膜上有斑点？
1） 转膜时尼龙膜与胶之间有气泡；
2） HRP标记的链霉亲和素中有杂质；
3） 封闭液或洗涤液有小颗粒，没有完全溶解。
3. 为什么检测不到信号或检测的信号低？
1） 使用的探针未标记；
2） 加入的标记探针量少，或者探针被降解；
3） 抗体效价低或者加入的抗体量过少；
4） 转膜失败；
5） 使用错误的膜进行转膜；
6） 曝光时间短；
7） 交联不成功；
9）实验过程中膜没有一直处于浸润状态；
4. 为什么检测不到DNA-蛋白复合物滞留带？
1） 涡旋或加热破坏了DNA-蛋白复合物的结构
2） 蛋白加入量较低或者蛋白降解
五 温馨提示
由于不同转录因子与DNA之间结合的强度不同，在实验中要对重组蛋白用量、探针浓度等因素进行摸索，以确定最佳实验体系。
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