快速检测基因的转录表达
在基因功能研究过程中，常常需要检测研究对象中目的基因的表达水平。逆转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR)常被用于分析基因的转录表达。RT-qPCR根据操作步骤的不同，可分为一步法和两步法。
一步法：反转录反应和qPCR反应在同一反应管中进行，对RNA进行直接定量。其操作简单、反应连续、污染概率低，适合于病原体的检测；
二步法：反转录反应和qPCR反应分两步进行。通过反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行qPCR，对RNA进行间接定量，多用于对多个基因的表达水平分析。
在实验过程中用的最多的，当属两步法RT-qPCR，它也是检测基因表达最基础、最经典的实验方案。两步法RT-qPCR包括三大步骤：RNA提取、逆转录成cDNA（反转录）、以及实时荧光定量PCR（qPCR）实验。
一、RNA提取
基本要求：尽量得到完整性好，纯度高，无基因组残留的RNA。
Tips：高质量RNA提取可参见往期推文：《Trizol的传世经典》
二、反转录
Tips
为了提高实验精准性，给出两个小建议：
1. 推荐使用含有基因组DNA（gDNA）去除成分的反转录试剂；
2. 使用Oligo(dT) Primer + Random Primers。
Coolaber新品RM201：cDNA第一链合成试剂盒(with dsDNase)可以满足用于qPCR模板的反转录需求。
产品组分
产品简介
NotionScript qPCR First-strand cDNA mix中包含了反转录所需的全部试剂，其中添加了Oligo(dT) Primer和Random Primers。并且本产品针对qPCR特别优化了oligo dT和随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。此外，本产品含有高效去除基因组DNA的dsDNase，可有效去除Total RNA中残留的gDNA，保证后续定量结果更加可靠。
产品特点
1.简便：反应体系配制简单，基因组去除与反转录可一步完成，避免了复杂加样过程造成的样品污染与RNA降解的风险。
2.快速：15 min即可完成反转录反应。
3.高效：反转录效率可达95%以上。
4.去基因组：产品含有dsDNase，可去除RNA模板中的基因组DNA残留。
5.适用于qPCR：反转录产物可直接用于qPCR检测，兼容染料法和探针法。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
三、qPCR
什么是qPCR？
Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR），是指在PCR体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过CT值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
为什么要做qPCR？
定量（多少）
1.相对定量：确定经过不同处理的样本中目标转录本的表达差异。
2.绝对定量：检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线。
定性（有无）
1.基因分型
2.转基因鉴定
3.病毒及病原菌检测
可使用Coolaber公司产品2×SYBR Green qPCR Mix(Coolaber # SL2690)进行qPCR实验。
产品简介：
2×SYBR Green qPCR Mix是利用染料法进行qPCR的专用试剂。已将DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR Green Ⅰ等试剂预混成mix。使用时只需要加入模板、引物和ddH2O。产品具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点。能够在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。
实验效果：
1.扩增曲线平滑，信号强度高，扩增特异性高
使用2×SYBR Green qPCR Mix
(Coolaber # SL2690)与G、T、N公司同类产品qPCR定量水稻Actin基因。以cDNA第一链合成试剂盒（Coolaber # RM201）反转录产物为模板，扩增曲线与溶解曲线如下图：
2.CT值大小正常，稳定。
使用Coolaber # SL2690与G、T、N公司同类产品qPCR定量水稻Actin、Tubulin、ubiquitin基因。以cDNA第一链合成试剂盒（Coolaber # RM201）反转录产物为模板，统计CT值。
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