团圆夜
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原生质体礼上加礼：助力金与干货齐送
露从今夜白，秋风至此凉。
Coolaber为做原生质体实验的小伙伴带来初秋时节的暖心好礼
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群里的小光同学为您解答原生质体实验问题
文末还有原生质体试验常见问题及解答哟~
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原生质体礼上礼
活动规则
即日起至2024年12月31日，使用Coolaber原生质体制备与转化试剂盒，在朋友圈分享你的实验结果（文案包含“Coolaber”、“原生质体”、“提取”、“转化”字样，图片包括试剂盒正面照、提取明场图、转化荧光图），并集赞38个，即可进群领取100元科研助力金。活动真实有效，快来参与吧~
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Coolaber原生质体试剂盒清单
Coolaber拥有拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米、马铃薯、番茄、大豆、柑橘、芸苔属等原生质体制备和转化的专业试剂盒，包含全套实验所需的试剂。
现有原生质体试剂盒见下：
模式植物：拟南芥，烟草，番茄
大作物：水稻，小麦，玉米，大豆
常见材料：马铃薯，芸薹属，辣椒，柑橘
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原生质体实验结果展示
1. 将10 μg去内毒素的pBI221-EGFP，转入拟南芥原生质体，转化效率高达57.38±13.1%，见图2。将10 μg去内毒素的pBI221-EGFP，转入玉米原生质体，转化效率高达48.32±6.28%，见图3。
图2 100倍镜检的拟南芥转化效率图（左明场，右荧光）
图3 100倍镜检的玉米转化效率图（左明场，右荧光）
2. 用不同量和不同质量的pBI221-EGFP，转入水稻原生质体，发现去内毒素且高浓度的质粒转化效率最高，为37.26±1.00%，见图4。
图4 水稻转化效率对比
3. 使用相关物种试剂盒的成果展示，见图5。
图5 40倍镜检的水稻转化效率图（左明场，右荧光）
图5 40倍镜检的小麦转化效率图（左明场，右荧光）
图5 200倍镜检的番茄转化效率图（左明场，右荧光）
图5 400倍镜检的大豆转化效率图（左明场，右荧光）
图5 400倍镜检的柑橘转化效率图（左明场，右荧光）
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原生质体实验常见问题
制备难
1. 首次接触原生质体实验，有什么建议？
答：建议先进行预实验，待熟练掌握操作步骤后，再进行批量实验。建议在重要步骤后，取样镜检，观察原生质体状态，以排除自身操作失误。例如在酶解、重悬、转化等步骤后，进行镜检，判断实验方法是否正确。同时建议使用pBI221-EGFP（VT118）质粒进行转化，便于观察原生质体荧光。
2. 酶解时包裹锡纸的目的是什么？
答：其目的是保证酶解时的避光条件。光照会引起原生质体的光合作用和氧化反应，可能会影响原生质体膜活性，造成氧化损伤。因此避光可有效保护原生质体的活性与完整性，便于后续质粒的转入。例如在冰上孵育、转化、过夜孵育等步骤都需要保持避光条件。
3. 酶解出的原生质体数量少怎么办？
答：
1）选用新鲜组培苗，保证良好的植物状态。
2）用锋利刀片将材料切为0.5-1 mm的组织，增加与酶解液接触面积。
3）增加抽真空步骤，使酶解液完全浸入。
4）增加酶解时间，使其酶解充分。
5）在过滤时，用镊子挤压未被酶解组织。此步骤最为重要！
6）在重悬清洗弃上清时，避免损失沉淀。
4. 酶解出的原生质体破碎怎么办？
答：
1）原生质体十分脆弱，整个实验需尽量温柔操作。包括：用平滑的剪尖枪头吸打、用水平转子、缓慢的升降速离心、较低的离心力、圆底离心管进行离心等。
2）实验材料应选取新鲜健康的植株。
3） 挤压过滤时，应缓慢且用力的挤压，切忌快速捣戳植物组织。
5. 没有水平转子可以用角转子代替吗？
答：水平转子的效果会更好，但是角转子仍可正常进行实验。建议将离心力和升降速调低，增加离心时间，以使原生质体缓慢的离心至管底。
6. 在离心后，原生质体呈絮状沉淀，不易再次重悬，会有影响吗？
答：造成絮状沉淀的原因：①酶解后植物组织被过滤至离心管内；②原生质体因操作大量破碎；③原生质体量多大。解决方案：建议取样镜检，若原生质体质量较好，即可进行后续实验，不影响结果。
转化难
7. 已制备的原生质体需要立即进行转化吗？
答：需要。请计划实验时间，以便正常完成实验流程。制备后的原生质体请一次使用完毕，不能搁置第二天再次进行转化。同样，过夜孵育后的原生质体不能择日观察。
8. 原生质体转化效率低怎么办？
答：
1）原生质体浓度过高。在MMg重悬原生质体时，应调整其浓度，以免原生质体过多，导致超出体系转化限度。
2）应采用浓度＞1 μg/μL的去内毒素质粒。经验证，在植物原生质体转化实验中，去内毒素质粒较未去内毒素质粒的转化效率高1倍。
3）原生质体未与PEG混匀。必要时，可将离心管缓慢颠倒，并耐心的用枪头吸打，以保证在原生质体未破碎的情况下，使两者完全混匀。
9. 转化后原生质体大量破碎怎么办？
答：请将枪头贴于液面，加入PEG。以免高密度的PEG液滴砸向原生质体，导致物理破碎。
10. 共转时质粒的建议用量？
答：建议2种质粒的浓度为1000 ng/μL，各加入10 μL。
11. 怎么判断原生质体是否成功转化？
答：建议在实验过程中，增加荧光质粒（pBI221-EGFP）以做阳性对照。若过夜孵育后可观察到荧光，即默认实验组也可正常完成转化，可进行后续相关实验。
12. 孵育后原生质体的破碎是什么原因导致的？
答：若使用圆底离心管过夜孵育的方法会使原生质体破碎，建议使用下述更柔和的孵育方法进行实验。用1 mL 10%BSA润洗细胞培养板后，将1 mL培养液加入细胞培养板备用。将1 mL培养液重悬原生质体，将其加入上述细胞培养板中，室温过夜培养。
购买难
13. 购买Coolaber酷来搏原生质体试剂盒后，还需要额外购买其他产品完成实验吗？
答：本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，无需购买额外产品。但是仍建议购买“去内毒素质粒大提试剂盒（增强型）（PE036）”配合感受态和培养基进行质粒提取，经本公司实验证明，去内毒素后的质粒更适用于原生质体转化。
14. 可以定制某种植物的原生质体试剂盒吗？
答：该问题烦请与本公司客服了解。对于特殊物种，本公司的售前服务会提供相关的酶解与转化建议，为客户提供实验思路与试剂定制服务。
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