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植物高质量原生质体的提取
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原生质体简介
图 植物细胞
原生质体是细胞壁以内各种结构的总称。植物原生质体与细胞一样具有完整的遗传物质，可维持细胞的各项基本生命活动。
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应用领域
瞬时表达（信号转导、离子转运、亚细胞定位）、蛋白质互作验证（BiFC、FRET、荧光素酶互补和蛋白质免疫共沉淀）、单细胞测序、体细胞杂交、原生质体培养与植株再生等。
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提取流程
Coolaber使用常规的原生质体提取方法，酶解法酶解植物细胞壁，通过细胞筛过滤获得原生质体。随后用培养液洗涤杂质，最后获得原生质体。Coolaber原生质体制备与转化试剂盒能够保证原生质体分离的稳定性和较高的转化效率。
图 原生质体提取流程
图 100×拟南芥原生质体
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注意事项
原生质体提取是一项需要操作门槛的实验，每一步都需要研究者认真对待。
1. 酶选择：通过尝试不同的酶种类组合与酶解时间，确定酶解该植物细胞壁专一的酶解配方。保证恰好完全酶解细胞壁得到原生质体，又不过度酶解伤害细胞。
酶解缓冲液的选择：选择适当的渗透压和离子浓度，可保证得到的原生质体有稳定的生存条件，不会破碎或皱缩。
2. 酶解液的配制：配制完成后，55℃ 水浴10 min，激发酶活性。
3. 植物材料的准备：取7-14 d嫩叶约1 g，平行主叶脉，用锋利刀片切丝，浸没于酶解液中。幼嫩的材料所提取的原生质体质量好且数量多。
4. 若植物材料漂浮于酶解液上，可增加抽真空步骤。
5. 酶解：45 r摇床，孵育约4 h。通常酶解时间约为4-6 h，不建议酶解过长时间。如特殊情况需要过夜酶解，建议将酶解液过滤除菌，或添加氨苄、头孢等抗生素，以防酶解液长时间暴露在空气中，生成杂菌，影响原生质体的生存。
6. 过滤：将酶解后的液体及植物组织过滤，使用圆底离心管收集。圆底离心管可减缓后续离心步骤的压力，以防原生质体破碎。
7. 重中之重：酶解后，少量原生质体脱离植物组织，游离于酶解液中，但是大量的原生质体仍存在植物组织中无法释放。
8. 所以请务必用枪头尾部或镊子，将细胞筛上的植物组织缓慢且用力挤压，此时可观察到有浓绿色液滴滴落，此步骤是原生质体提取量的关键。后续用培养液润洗植物组织，并重复挤压。
9. 收集：过滤完成后，使用水平转子、缓慢的升降速、离心力，将原生质体收集。保证原生质体可温柔地沉降于圆底离心管底部，不破碎。
10. 清洗：弃上清后，使用切尖枪头，用培养液对其进行重悬。再次离心，即可得到纯净的原生质体。请使用锋利刀片对枪头进行剪切，保证切口平滑，不会在吹打的过程中，划伤原生质体。切尖枪头的口径大且吸力小，在重悬过程中会减少对原生质体的损伤程度。
11. 培养：原生质体培养需要在避光条件下进行。光照会引起原生质体的光合作用和氧化反应，可能会影响原生质体膜活性，造成氧化损伤。因此避光可有效保护原生质体的活性与完整性，便于后续实验。
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详细资料
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恰饭
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