Toll样受体（TLRs）作为检测病原体相关分子模式（PAMPs）的跨膜受体在先天免疫中起着关键作用。这些受体可以通过形成高阶组装体来识别和响应微生物成分。人类拥有10个已确定的TLR家族成员，而小鼠拥有约12个。每个TLR都具有一个用于配体结合的细胞外结构域、一个跨膜片段和一个细胞内Toll/IL-1R （TIR）结构域。来自细菌或病毒的PAMPs与TLR外结构域的相互作用可以促进TIR结构域的二聚化。这种二聚化是启动激活免疫反应的下游信号通路的关键。TIR根据其位置和配体的性质进行分类：一些位于细胞膜上，在那里它们对脂质或蛋白质配体作出反应，而其他的，包括TLR3， TLR7， TLR8和TLR9，位于核内体中，并被这些隔室内的外来核酸激活。
TLR3在免疫应答中起着关键作用，主要位于内溶酶体中，并通过识别指示病毒感染或炎症过程的双链RNA （dsRNAs）而激活。TLR3的胞外结构域（ECD）通常作为单体存在于溶液中，但在dsRNA上进行组装以启动信号复合物。这个组装过程对于TLR3的激活至关重要，这并不取决于RNA序列，而是取决于dsRNA的长度和酸性pH条件（范围从5.5到6.5或更低）。为了使TLR3有效地发出信号，需要一个包含TLR3二聚体的最小单元，由两个TLR3分子在40-50个碱基对的dsRNA片段上协同组装而形成。然而，较长的dsRNA链的存在可以促进四聚体甚至更大的多聚体复合物的形成，从而提高TLR3的激活效率。为了阐明信号复合物形成的机制，已经做了一些努力。TLR3中H539E和N541A位点的突变破坏了它的激活和配体结合能力，确定了这些残基对dsRNA相互作用至关重要。进一步的结构分析证实了它们在TLR3结合位点的关键位置。此外，库仑相互作用在TLR3二聚体组装成高阶簇中起着至关重要的作用，这对于有效的信号传导至关重要。这种组装过程是由一个TLR3蛋白的带负电的N端和另一个带正电的C端之间的吸引力促进的，突出了相邻二聚体界面上这些静电力的重要性。
通过线程相互连接，以减少CpHMD期间滴定的残基数量（图源自Advanced Science ）
TLR3与dsRNA的pH依赖性结合突出了其功能的一个关键方面，可能受到某些残基pH敏感性的影响。分子动力学模拟提供了一种方法来深入研究这些残基的原子水平行为，特别是关注它们在配体结合过程中的质子化和去质子化。然而，传统的分子动力学模拟，假设恒定的质子化状态，面临显著的局限性。这包括对可滴定残基的pKa值的精确知识的要求，以准确地分配正确的质子化状态。当残基的pKa接近系统的pH值时，这种方法就会出现问题，因为没有单一的质子化状态可以完全捕获残基的行为。此外，传统的方法与质子耦合动力学（如特异性蛋白质-配体相互作用）相斗争，这在TLR3/dsRNA信号复合物中至关重要。
由于TLR3/dsRNA复合体由多个可滴定残基组成，包括蛋白质中的Asp、Glu、His、Lys、Tyr、Cys以及dsRNA中的磷酸基和碱基对，因此使用传统的分子动力学模拟方法研究TLR3/dsRNA复合体尤其具有挑战性。值得注意的是，每个TLR3分子约有8个组氨酸残基位于与dsRNA的界面上。由于组氨酸的pKa（6.5）在活性信号复合物的pH范围内（5.5-6.5），传统的分子动力学模拟无法准确模拟组氨酸的行为。为了克服这些挑战，基于结构背景和特定pH值动态采样质子化状态的恒定pH分子动力学（CpHMD）模拟是必不可少的。CpHMD通过调节不同pH条件下残基的波动质子化状态，可以更准确地研究TLR3/dsRNA复合物。这种方法对于理解信号复合体内复杂的pH依赖性相互作用至关重要。
研究首先研究了TLR3单体的结构基础，并重点研究了它如何组装成TLR3/RNA四聚体信号复合物。研究采用了分子动力学模拟、恒定pH （CpHMD）模拟和元动力学的组合。通过一系列恒定pH值模拟（pH值范围为3.5、4.5、5.5、6.5、6.6和7.4），构建了TLR3单体中所有Asp、Glu和His残基的滴定曲线。能够详细检查这些残基的质子化状态和行为在不同pH条件下的变化。然后，将CpHMD模拟扩展到四聚体信号复合物，以探索其在生理条件下的稳定性和动力学。计算了活性信号复合物在酸性pH为6.0时解离成单体的自由能图谱。此外，研究评估了更高pH值（7.4）对这一解离过程的影响，从而深入了解了TLR3信号复合物的pH依赖性动力学。
参考消息：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202411445
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