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作者：陈素婷，尚园园，郑继芳，霍凤敏，薛毅，赵立平，姜广路，初乃惠，黄海荣
第一作者及单位：陈素婷，首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室；尚园园，首都医科大学附属北京友谊医院
通信作者及单位：初乃惠，首都医科大学附属北京胸科医院结核一科；黄海荣，首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室
In vitro monitoring of drug resistance emergence during stepwise induction of bedaquiline and clofazimine, alone and in combination: a phenotypic and genotypic analysis.
Chen S, Shang Y, Zheng J, Huo F, Xue Y, Zhao L, Jiang G, Chu N, Huang H.
J Antimicrob Chemother, 2024 Nov 11: dkae405.
doi: 10.1093/jac/dkae405.
PMID: 39523472.
研究背景
耐药结核病的诊疗是结核病防控的重点和难点。据世界卫生组织（WHO）的最新统计数据显示，进行耐药结核病治疗的患者仅占预估耐药结核病患者的43%左右，治疗成功率也仅为63%，提示如何提高治疗成功率是耐药结核病防控应重点关注的问题。WHO优先推荐A组和B组药物组成耐药结核病治疗方案，在整个治疗期间需要在强化期保证有效药物≥4种，巩固期停用贝达喹啉（Bdq）或利奈唑胺（Lzd）并至少保留3种有效药物；Bdq是1.1类抗结核新药，诸多临床研究证实Bdq的使用可提高耐药结核病的治疗成功率及降低死亡率。氯法齐明（Cfz）作为B组药物，尽管与Bdq的作用机制不同，但两药之间存在一定比例的交叉耐药。随着全球大规模使用Bdq和Cfz，需要警惕Bdq和Cfz耐药菌株的流行，其会影响治疗方案中有效药物的个数，从而最终导致耐药结核病治疗失败。
实际上，在Bdq引入临床不久后就报告了治疗失败的病例，其中大部分患者出现Bdq的获得性耐药，随后越来越多的学者关注Bdq的耐药问题，从体外及临床菌株中筛选耐药菌株以阐明Bdq耐药发生的机制，目前报道的Bdq耐药相关基因主要包括Rv0678、atpE、pepQ和glpk。其中临床菌株中发现的突变主要存在于Rv0678和atpE; 而pepQ和glpk突变主要是体外诱导耐药菌株中发现的。在既往研究中，Rv0678基因存在超过200余种变异形式，散在分布在基因全长及上游启动子区，没有热点变异位点；而atpE的突变类型有10余种，目前也没有明确的耐药突变位点，这对耐药分子诊断技术的开发提出了很大的挑战。
Cfz是一种老药，在20世纪50年代时开发作为抗结核药物，后来用于麻风分枝杆菌病的治疗，之后在近年又被WHO推荐为治疗耐药结核病的B组药物。Cfz主要通过干扰细胞膜线粒体ATP的合成，促进菌体内ROS的产生等机制发挥抗菌作用。已知的耐药相关基因包括Rv0678、pepQ、Rv1979c和Rv1453。
其中，Rv0678被证明为是最主要的导致Lzd和Bdq低水平耐药和交叉耐药的主要原因。Rv0678是MMPL5/MMPS5外排泵的转录抑制因子，当其发生突变后，会导致该外排泵基因的表达水平升高，从而将Cfz或Bdq外排到菌体外，降低菌体内的药物水平，从而表现为对Cfz和Bdq不敏感。大部分临床分离耐药菌株突变基因集中在Rv0678。但仍有一些研究表明可能还存在其他未知的耐药基因，尤其是Cfz耐药临床菌株中仅有部分菌株存在已知的Cfz耐药基因突变，仍需对Cfz耐药机制进行探究。
目前，Bdq和Cfz体外诱导耐药研究均在Bdq单药或Cfz单药条件下进行，尚无Bdq和Cfz联合诱导下的耐药菌株研究。特别对于Bdq和Cfz两药与单药诱导条件下的耐药演化过程有何差异是本研究关注的重点，因为临床存在一定比例同时使用Bdq和Cfz治疗耐药结核病的患者。
研究方法
采用体外诱导耐药的方式，设计了3组诱导耐药实验，分别是Bdq、Cfz，以及Bdq联合Cfz，采用倍比递增药物浓度方法，从1/2 MIC到32倍MIC对H37Rv单克隆菌株进行诱导耐药，收集诱导过程中的混合菌群和最高浓度药物板上的耐药单克隆菌株，分别进行全基因组测序和已知耐药相关基因的Sanger测序（图1）。
注 Bdq：贝达喹林；Cfz：氯法齐明
图1 耐药菌株诱导过程示意图
研究结果
首先，诱导过程中各代菌株的Sanger测序结果显示，Bdq和Cfz单药诱导均是在4MIC时就检测到Rv0678突变，两者的突变类型不相同；而两药联合时，并未检测到已知的耐药相关基因突变。此外，从耐药表型来看，随着诱导药物浓度的升高，诱导过程收集菌株的Bdq和Cfz的MIC均升高。
同时，对诱导过程中的各代菌株进行了二代测序，结果显示所有诱导过程中的菌株仅存在Rv0678突变（图2），而未发现其他已知耐药基因在诱导过程中发生突变。并且，Rv0678突变在Bdq暴露的1MIC下就可发生，而且突变类型多样；Cfz诱导则在4MIC时检测到Rv0678突变。两药联合诱导时，也是在1MIC时即可发现Rv0678突变。
注 *：终止密码子变变；#：起始密码子突变；！：开始丢失；Bdq：贝达喹林；Cfz：氯法齐明
图2 Rv0678基因突变的进化
对比一代测序和二代测序的结果，发现当菌群中耐药突变菌株占比较低时，一代测序方法存在漏检风险；诱导过程中收集的菌株混合物存在较大异质性，不同突变类型菌株的占比均较小，通过一代测序不能准确地检测出耐药靶基因的突变类型及占比；Bdq暴露的情况下，在诱导二代开始就出现Rv0678突变；而Cfz暴露时，在诱导第4代才出现Rv0678突变，这表明Bdq相较Cfz更易发生Rv0678突变，且Cfz联合Bdq并不会延迟Rv0678突变的发生。
最后，在最高药物板上分别挑取了100株左右的耐药单克隆菌株，并对其进行已知耐药基因的一代测序（表1），分析耐药相关基因的突变情况，发现Bdq单药诱导的耐药菌株主要存在Rv0678突变，有少部分菌株同时存在atpE和Rv1979c基因突变。而Cfz单药诱导耐药菌株的突变则仅存在于Rv0678基因。双药诱导耐药菌株全部存在Rv0678突变，少部分存在Rv1979c和pepQ突变。但尚不明确Rv1979c和pepQ突变对Bdq或Cfz耐药的贡献度。
随机挑选了几株不同诱导条件下获得的耐药菌株，检测耐药菌株对其他二线抗结核药物的敏感度（表2），未发现耐药突变株发生对其他抗结核药的耐药。表明即便发生Rv0678基因突变，可能导致外排泵基因的表达升高，但该外排泵对药物的外排作用可能仅限于Bdq和Cfz。
研究结论
1、不论是Bdq还是Cfz暴露，耐药突变主要发生于Rv0678基因，一旦发生Rv0678突变，会导致Cfz和Bdq的MIC升高2～4倍；
2、Bdq较Cfz更易诱导发生Rv0678突变，而Cfz和Bdq的联合使用并不会延缓Rv0678突变的发生，但可延迟atpE突变的发生，降低Bdq高水平耐药的发生；
3、Rv0678突变并无热点区域，散在分布在基因全长；
4、在双药诱导过程中，更易发生Rv0678的插入或缺失突变；而单药诱导过程中，更易发生Rv0678单碱基替换突变；
5、所有挑取的耐药单克隆菌株均保留对其他抗结核药物的敏感度，MDR/RR-TB治疗方案设计应防止Bdq耐药的出现，并应使用表型药敏试验来指导和监测治疗。
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供稿：陈素婷
编辑：孟 莉
审校：范永德
发布日期：2024-11-26
