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作者：阳幼荣，薛勇，王小鸥，王兰，王杰，张俊仙，刘银萍，梁艳，吴雪琼
第一作者：阳幼荣，薛勇
通讯作者：梁艳，吴雪琼
作者单位：解放军总医院第八医学中心结核病研究所
Bioinformatics analysis and immunogenicity assessment of the novel multi-stage DNA vaccine W541 against Mycobacterium tuberculosis
Yang Y, Xue Y, Wang X, Wang L, Wang J, Zhang J, Liu Y, Liang Y, Wu X.
Immun Inflamm Dis, 2024 Nov;12(11):e70074.
doi: 10.1002/iid3.70074.
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）引起的一种传染病，潜伏结核感染（Latent Tuberculosis Infection, LTBI）在特定条件下可能发展为活动性结核病。疫苗接种是预防LTBI进展为活动性结核病的有效措施之一，然而目前广泛使用的卡介苗（BCG）对成人肺结核的保护效果有限，因此开发新的结核疫苗显得尤为重要。
近年来，随着生物信息学方法的发展和互联网数据库的应用，研究人员能够更高效地选择蛋白质中的优势表位来构建疫苗，并预先评估疫苗的免疫效果，从而提高疫苗研发的效率。
1、疫苗构建
研究团队将结核分枝杆菌的四个抗原（Ag85A、Ag85B、Rv3407和Rv1733c）的免疫优势序列串联起来，构建了名为W541的多阶段DNA疫苗。
2、生物信息学分析
2.1分析了W541疫苗蛋白的理化性质，包括分子量、溶解性、半衰期和不稳定性指数。
2.2评估了疫苗的抗原性、过敏性和毒性，以确保其作为候选疫苗的安全性和有效性。
2.3 对疫苗蛋白的三级结构进行了预测并分析了疫苗蛋白分子与TLR4之间的结合能力。
2.4 预测了疫苗中可能存在的表位，特别是HTL（辅助T细胞）、CTL（细胞毒性T细胞）和B细胞线性及非连续表位，基于T细胞表位情况预测了W541疫苗人群覆盖率及T细胞表位与MHC分子对接情况。
2.5 模拟免疫反应：通过计算模型模拟了W541疫苗在体内的免疫反应，评估它刺激先天和适应性免疫系统的能力。
3、动物实验
为了验证生物信息学分析的结果，并进一步评估W541疫苗的免疫原性，研究者在小鼠中进行了体内实验。实验比较了接种W541疫苗组与对照组之间的免疫反应差异，特别关注了Th1型和Th2型细胞因子的表达水平，如IFN-γ、IL-17A、IL-4、IL-6和IL-10。
1、W541疫苗蛋白的特性
通过生物信息学分析，发现W541疫苗蛋白是一种可溶性的细胞质蛋白，具有良好的抗原性和广泛的人群覆盖率，并且没有表现出过敏性和毒性。该蛋白在体内的半衰期为1.1小时，不稳定指数为45.37。
2、W541蛋白与TLR4的分子对接结果
W541蛋白的中心区域与TLR4的B链有显著的结合亲和力，表明W541蛋白有可能激活TLR4，从而增强免疫反应。
3、W541疫苗蛋白的B细胞表位和T细胞表位
预测结果显示，W541疫苗蛋白有15个线性B细胞表位和11个不连续B细胞表位，以及138个HTL表位和73个CTL表位，其中多数能够诱导IFN-γ的产生，表明该疫苗蛋白具有激活TH细胞的能力。HTL和CTL表位的人群覆盖率分别为99.68%和98.36%，表明W541疫苗具有广泛的群体覆盖潜力。
4、免疫模拟
模拟结果表明，W541 DNA疫苗能够有效激活先天免疫细胞和适应性免疫细胞，特别是TH和TC细胞，并诱导高水平的IFN-γ和IgG、IgM抗体产生。
5、实验验证
5.1 W540重组蛋白表达：含有W540重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG诱导下在中表达W540蛋白，通过SDS-PAGE显示约70 kDa的蛋白带。
5.2 疫苗诱导抗体的产生：在W541疫苗组、对照组和pVAX1组之间，针对W540蛋白的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平没有显著差异，表明W541 DNA疫苗并未显著提高抗体水平。。
5.3 ELISPOT实验：W541疫苗组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的数量显著高于对照组和pVAX1组，表明W541 DNA疫苗能有效地激活小鼠的脾淋巴细胞，并在W540蛋白刺激下产生强烈的二次免疫反应。
5.4 细胞因子分析：经W540蛋白刺激的W541疫苗组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-17A的水平显著升高，而IL-2水平没有显著差异。Th2型细胞因子IL-4和IL-6的水平在W541疫苗组中降低，而IL-10水平没有显著差异，表明W541 DNA疫苗主要诱导了Th1型免疫反应。
这些实验验证结果表明，W541 DNA疫苗在小鼠模型中主要诱导了Th1型免疫反应，有效激活了IFN-γ和IL-17A的产生，而对Th2型细胞因子的影响较小。尽管W541疫苗组的抗体水平没有显著增加，但其在激活细胞免疫反应方面表现出潜力，特别是在激活能够产生IFN-γ的Th1细胞和细胞毒性T细胞（CTL）方面。这些发现为进一步优化W541疫苗的设计和免疫策略提供了重要信息。
生物信息学分析的结果与动物实验数据之间存在强正相关，证实了生物信息学分析在疫苗研究中的价值。W541 DNA疫苗可诱导强烈的细胞免疫反应。然而，为了使表达的蛋白在体内更加稳定，还需要进一步优化疫苗设计。生物信息学分析可以揭示疫苗的理化和免疫学信息，对指导疫苗的设计和开发具有重要意义。
注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社的观点。
编辑：王 然
审校：郭 萌
发布日期：2024-12-09
