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Journalist's Day
作者：王文敬，侯悦，张婧芳，孙照刚，孙宏
第一作者及单位：王文敬，首都医科大学附属北京胸科医院转化研究中心
通信作者及单位：孙照刚和孙宏，首都医科大学附属北京胸科医院转化研究中心
Improved Isolation Optimizes Downstream Application of Extracellular Vesicles Derived from Mycobacterium tuberculosis
Wenjing Wang, Yue Hou, Jingfang Zhang, Zhaogang Sun and Hong Sun
Microorganisms, 2024, 12:2129.
doi: 10.3390/microorganisms12112129.
PMID: 39597520.
研究背景
结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的，在每个国家均有发生，仍然是全球主要的传染性死亡病因之一。MTB已经进化出复杂的机制来操纵宿主细胞的生理过程，并逃避宿主的免疫系统。这些相互作用很大程度上由MTB的细胞包膜成分介导，这些成分现在被认为可通过细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）释放到细胞外。当前，已经建立多种EVs分离方法，包括超速离心、超滤、商业试剂盒、新型免疫亲和捕获方法和微流控技术，方法的选择影响所提取EVs的数量、颗粒大小和蛋白质质量，进而影响下游应用，特别是功能研究。对于MTB EVs的分离，目前报告的方法有限，包括超速离心、密度梯度离心、超滤和尺寸排阻色谱，但尚无MTB EVs分离方法的比较研究，这些方法对下游应用的影响尚不清楚。鉴于MTB EVs在促进医疗诊断、预后，以及理解MTB的致病机制中的关键作用，建立一种从培养介质中分离EVs的精细、可靠且高效的方法是至关重要的。本研究拟使用3种方法[包括超速离心（DC）、商业分离试剂盒（EI）和EXODUS微流控芯片]对H37Rv的EVs进行分离，并比较不同方法分离的EVs之间的差异，还对其下游应用进行了初步调查。
研究方法
本研究首先在二级生物安全实验室复苏H37Rv菌株，并在37 ℃培养21 d后，离心收集上清液。在经0.22 μm滤器过滤后，分别使用DC、EI与EXODUS三种方法分离H37Rv EVs（操作流程见图1）。随后对3种分离方法分离到的H37Rv EVs进行透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）分析、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）、蛋白比较分析及免疫效应分析，筛选出更加适用于H37Rv EVs下游功能研究的方法。最后使用小动物成像探究H37Rv EVs穿越血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的能力，以及对小鼠脑部炎症反应的影响，期望揭示H37Rv EVs在结核病中的复杂作用，为进一步理解结核病的致病机制和探索新的治疗策略提供宝贵的信息。
注：1：DC；2：EI；3：EXODUS
图1 H37Rv EVs提取的3种技术路线图解
研究结果
TEM分析显示，使用DC、EI和EXODUS方法分离的H37Rv EVs直径均为小于200 nm的球形粒子。此外，TEM分析还表明，与EI试剂盒相比，使用EXODUS方法分离的EVs含有更少的杂质（图2）。NTA分析同样显示3种方法分离出的EVs粒径范围一致（<200 nm），且EI方法分离出的H37Rv EVs粒子数量最多。
注 左图：DC；中图：EI；右图：EXODUS
图2 H37Rv EVs电镜图
蛋白分析显示，EI法分离到的H37Rv EVs蛋白含量最高（8.4583 mg）（图3a），3种方法分离H37Rv EVs中有共享和独特的蛋白（图3b）。纯化蛋白衍生物（PPD，含有多种MTB抗原性成分的复杂蛋白混合物）的免疫印迹分析显示，与另外两种方法相比，使用EXODUS方法分离的EVs中含有更多种类的MTB蛋白质（图3c）。此外，使用EI试剂盒分离的H37Rv EVs在分泌蛋白MPT64（一种在MTB感染中起关键作用的特定抗原）抗体染色中呈阴性（图3d），表明在使用EI方法的过程中，某些MTB成分有显著损失。
图3 3种方法分离的H37Rv EVs中蛋白含量与成分分析
免疫效应分析显示，H37Rv EVs能够被巨噬细胞RAW264.7吞噬在细胞质中，并在6 h达到峰值，此后胞吐大于胞吞（图4）。由于H37Rv EVs含有Toll样受体2（TLR2）的激动剂，研究团队调查了RAW264.7细胞内化H37Rv EVs后TLR2信号通路的免疫炎症反应。使用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）实验来评估H37Rv EVs在诱导后24 h对RAW264.7细胞活力的影响。如图5a所示，无论使用哪种分离方法，细胞在用5 μg每孔的H37Rv EVs蛋白培养24 h后，其活力均显著降低。此外，通过不同方法分离的H37Rv EVs激活了TLR2及细胞炎症因子（如IL-6和TNF-α）的表达（图5b，5c，5d）。值得注意的是，尽管DC和EI方法也导致了炎症因子的增加，但它们的效果差异并不显著，而EXODUS方法在刺激RAW264.7细胞炎症因子表达方面表现出更高的能力。
图4 H37Rv EVs被RAW264.7细胞吞噬
图5 H37Rv EVs对RAW264.7后的免疫效应
EXODUS方法分离的H37Rv EVs含有更多的MTB成分，并显示出更强的细胞免疫力，使其在下游分析和应用中更具实用价值。因此，在后续动物实验中，研究者采用了此方法分离的H37Rv EVs。将200 μg的H37Rv EVs通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，使用苏木精-伊红（H&E）染色法在注射后的第0、3、6和10天监测大脑组织的病理变化。随着时间的推移，在大脑中引起了炎症反应和神经元变性，尤其是在小脑和海马区。这些变化在第3天最为明显，随后在第6天和第10天有所减轻，但仍持续存在（图6）。这些结果提示H37Rv EVs可能触发了大脑炎症。BBB是一个由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的特殊保护屏障，它确保了神经微环境的完整性，并保护大脑免受血液中的微生物和毒素侵害。为了证实H37Rv EVs能够穿透BBB并评估它们在活体中BBB的穿透能力，研究通过静脉注射将DiI标记的H37Rv EVs注入到裸鼠体内，并捕获了近红外荧光图像（图7a，7c）。结果显示，H37Rv EVs在尾静脉注射后1 h内即可被检测到存在于小鼠大脑组织中，并在给药后12 h达到荧光强度的峰值，随后逐渐减少（图7a，7b）。此外，对离体大脑的体外成像清楚地显示了DiI-H37Rv EVs在大脑中的分布，尽管荧光强度比活体观察到的稍弱（图7c）。匀浆器官组织的分析显示，在12 h时肝脏的荧光强度比对照组高3.13倍，大脑的荧光强度比对照组高1.56倍（图7d）。这些发现进一步证实了H37Rv EVs可进入大脑和肝脏，并具有穿越BBB引发大脑炎症反应的能力。
图6 注射H37Rv EVs后的第0、3、6和10天小鼠脑组织的H&E染色（比例尺为50 μm）
图7 小鼠体内H37Rv EVs的分布情况
研究结论
综上所述，本研究描述了通过DC、EI和EXODUS分离的H37Rv EVs的显著特征，EXODUS被确定是一种方便和可靠的H37Rv EVs分离方法，特别适合下游应用。研究发现，H37Rv EVs可激活TLR2信号通路，刺激RAW264.7细胞的炎症反应，并可突破BBB引发脑炎症反应。这些发现为MTB诱导的中枢神经系统疾病的发病机制提供了新的思路，并提示H37Rv EVs可能作为预防结核病患者血脑屏障破裂和脑炎症的潜在治疗靶点。
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供稿：王文敬
编辑：孟 莉
审校：范永德
发布日期：2024-12-06
