综述 | 舒畅/张大志：应用单细胞转录组测序技术揭示慢性乙型肝炎免疫学特征的研究进展

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的以肝脏病变为主的一种传染病。世界卫生组织数据显示，2019年全球大约有2.96亿人存在慢性HBV感染，部分发展为肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭等终末期肝病，最终导致82万人死亡 ［1］。由于共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的持续存在和特异性抗病毒免疫功能的失调，目前的治疗药物并不能完全消除HBV感染 ［ 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ］ 。CHB的发病机制十分复杂，主要与宿主免疫反应相关。更好地理解CHB的免疫发病机制，找到新的治疗靶点，开发更多有效的治疗方法，有望实现功能性治愈 ［7］ （HBsAg消失），甚至完全治愈（cccDNA和整合的HBV DNA清除）。

既往研究多使用批量转录组测序，掩盖了单个细胞的异质性，很难精确表征免疫机制。而单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是对转录组进行单个细胞水平上的高通量测序，通过捕捉细胞类型和细胞状态的多样性，获得病理过程的新视角，有助于全面了解疾病的病理生理学，进而开发有效的治疗方案 ［8 , 9］ 。scRNA-seq已广泛应用于HBV相关的肝细胞癌和慢加急性肝衰竭等疾病的研究中 ［ 10 , 11 , 12 ］ ，提高了我们对这些疾病的总体理解。本文将主要阐述应用scRNA-seq技术揭示的CHB相关免疫学特征，以期为CHB治疗提供新视角。

现有的自然史分期缺乏直接免疫学证据，不能很好地划分各期的免疫表型差异 ［13］ 。scRNA-seq的出现使我们可以精确识别HBV感染下外周和肝脏中免疫细胞的激活状态、不同免疫细胞类型的基因表达变化等，这对理解CHB的免疫应答和自然进程至关重要。

最近，Zhang等 ［14］ 使用scRNA-seq结合免疫组库分析，首次深度剖析了HBV感染后免疫耐受（immune tolerance，IT）、免疫活跃（immune activate，IA）、急性恢复（acute recovery，AR）、慢性消退（chronic resolved，CR）四个阶段肝脏和外周的免疫细胞图谱。肝脏中，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞在IA和AR期显著富集，γδT和B细胞在CR期中增加，自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）和NKT细胞在IT中富集，髓细胞在IT期和IA期富集。不同疾病阶段的CD8⁺T细胞和髓细胞的趋势在肝脏和外周血之间是一致的。CD8⁺T细胞亚聚类分析发现：与健康人相比，HBV感染者肝脏的黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cells，MAIT）显著减少，其中IA组的MAIT最少，这一发现与既往研究报道HCV慢性感染患者肝内MAIT细胞耗尽一致，可能是由炎症因子激活诱导的细胞死亡所致 ［15］。IT、IA和AR患者肝脏的CD8T_c08-LAYN细胞频率增加，该亚群耗竭得分最高，被称为耗竭T细胞（exhausted CD8⁺T，Tex），其中 IA组Tex最多；而AR组外周血中CD8T_c03-CX3CR1细胞（recently activated effector memory or effector T，Temra）最多，该亚群细胞毒性得分最高。推测AR可能通过强细胞毒性CD8⁺T细胞反应来有效控制HBV感染。肝内Tex在IA中主要由肝内效应记忆T细胞耗竭而来，而在AR中主要源于外周Temra的浸润与转化。AR期外周血中CX3CR1⁺GNLY⁺中央记忆CD8⁺T细胞亚群明显扩增可作为预测HBV清除的免疫指标。调控CD8⁺T细胞功能和分化对控制HBV感染有重要的意义。CD4⁺T细胞亚聚类分析发现，CD4T_c10-CXCL13亚群在AR肝脏中富集，表达类似滤泡辅助性T细胞的转录特征，提示该亚群在AR中可能参与体液免疫辅助B细胞产生抗体。肝内驻留的调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）CD4T_c09-CTLA4表现出较高的调节效应功能，且在IT和IA均增加。而另一项研究 ［16］ 发现相比于健康人和HBeAg阴性的乙型肝炎患者，IA和IT期外周血中的Treg亚群CD4⁺CXCR5 -FOXP3⁺T细胞频率更高，且免疫抑制特征［程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）］明显上调。这两种Treg亚群可能与宿主对病毒复制的免疫耐受有关。髓细胞亚聚类分析显示：具有吞噬和抗原提呈能力的macro_c01-C1QC以及高表达抗病毒干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）和免疫调节基因的调节性巨噬细胞（regulatory macrophage，Mreg）macro_c03-FCGR3A主要存在于肝脏中，且主要在IT富集。细胞互作网络分析发现，IA和IT中存在Mreg-Tex-Treg强相互作用，主要表现为Mreg可能通过人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-I_白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B（leucocyte immunoglobulin-like receptor，LILRB）信号调节CHB的T细胞反应，Treg可能通过HLA-B_钙联结蛋白（calnexin，CANX）、杀伤细胞凝集素样受体D1（killer cell lectin like receptor subfamily d，member 1，KLRD1）_ HLA-E等配体-受体（ligand-receptor，L-R）反应控制CD8⁺T细胞活化，从而导致CHB抗病毒免疫功能障碍。调节这些L-R反应可能有助于恢复T细胞抗病毒免疫功能。国外一项研究 ［17］ 同样对不同临床分期的CHB患者配对外周血和肝脏细针穿刺抽吸（fine-needle aspirates，FNA）样本进行scRNA-seq，发现不同临床分期下肝脏和外周血中非典型记忆B细胞（atypical memory B cells）的频率均较低。但肝脏中浆细胞频率明显高于外周血，尤其高病毒载量和转氨酶升高阶段（IA期和HBeAg阴性CHB期）。且肝脏浆细胞高表达MKI67，以IA期最显著，该基因被广泛用作细胞增殖的标志。故后续对浆细胞进行亚群分析和更多的功能研究对于深入了解CHB的体液免疫非常重要。

此外，许多研究对不同疾病阶段CHB患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）进行scRNA-seq分析也发现了不同于健康人的免疫特征。Jiang等 ［18］ 研究结果显示与健康人相比，HBeAg阴性慢性HBV感染者PBMC中CD4⁺T细胞比例显著降低，而γδT、树突状细胞和NK细胞比例显著增加。亚聚类分析显示：初始T细胞和Treg细胞的百分比降低，而效应T细胞和γδT细胞的百分比增加；幼稚B细胞的比例降低，而记忆B细胞和浆细胞的比例增加。还发现了3种特异性细胞亚群，分别为Pro-infla CD14⁺单核细胞、Pro-infla CD16⁺单核细胞和干扰素（interferon，IFN）⁺CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）-NK细胞，它们高度表达炎症相关基因｛趋化因子配体4［chemokine（C-C motif）ligand 4，CCL4］、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等｝、显著富集炎症相关通路［核因子（nuclear factor，NF）-κB信号通路、TNF信号通路等］，且细胞比例与HBsAg水平呈正相关，提示它们有可能作为潜在的治疗靶点。Wang等 ［19］ 研究结果显示，与妊娠中期健康孕妇相比，HBeAg阳性慢性HBV感染妊娠中期患者的PBMC中仅单核细胞和树突状细胞比例略增加。两组间差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）主要集中于单核细胞，基因本体（gene ontology，GO）富集分析显示HBV慢性感染孕妇上调的DEGs在生长负调控、细胞锌离子稳态和免疫调节等生物学过程中富集，而与免疫系统过程和先天免疫反应相关的功能被下调。单核细胞被分为8个亚簇，簇2、5、7抗病毒反应相关途径（如对IFN的反应、病毒基因组复制的负调控）下调，簇3（FCGR3A⁺）富含干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFN inducible transmembrane protein 3，IFITM3）和低亲和力免疫球蛋白G的Fc区域受体Ⅲ-A（low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor Ⅲ-A，FCGR3A），高表达抗病毒ISG、抑制病毒复制等基因。母婴传播是高流行环境中主要的传播方式之一 ［20］ ，上调簇2、5、7的抗病毒能力或提高簇3细胞比例，可能有助于预防HBV宫内感染。

以上研究采用scRNA-seq技术探讨了不同疾病阶段、不同生理状态下CHB患者的外周和肝内免疫细胞类型及功能的异质性，揭示了HBV感染不同阶段的肝内及外周免疫特征，有助于后续发现新的治疗靶点和预测疾病结局的生物标志物。但上述研究为横断面研究，不能反应疾病动态发展中的免疫变化。Genshaft等 ［21］ 开发了一种肝脏细针穿刺抽吸（fine-needle aspirates，FNA）联合scRNA-seq深入分析肝脏免疫状态的工作流程，使多站点国际研究成为可能，并有助于对同一患者在病程不同阶段实施多次肝脏选择性采样进行肝内免疫细胞的scRNA-seq，促进对HBV自然史的理解，推动HBV相关免疫学的研究进程 ［22］ 。除了纵向肝脏FNA采样外，构建模拟慢性HBV感染的细胞和小鼠模型也能动态展现在CHB患者中无法捕捉到的肝内免疫微环境变化。意大利学者Andreata等 ［23］ 为探索肝细胞启动导致HBV感染中T细胞功能障碍的独特特征，将初始表型的HBcAg特异性细胞受体转基因CD8⁺T细胞（naive Cor93 T cells，Cor93 TN）转入MUP-core转基因小鼠模型中，对其肝内Cor93T细胞进行scRNA-seq和体外实验，以模拟新生儿或围生期感染CHB的初始免疫应答。研究发现TNF受体超家族成员9（TNF receptor superfamily member 9，TNFRSF9，4-1BB）、TNFRSF4和CD278是最强诱导的共刺激基因，而4-1BB激动剂能通过促进效应分子的表达和多个T细胞亚群的功能转换来显著恢复T细胞功能，可能为CHB患者提供一种新的免疫治疗策略。进一步对肝细胞诱导与库普弗细胞诱导的Cor93T细胞进行scRNA-seq发现，肝细胞启动产生了一个稳定且异质的功能失调记忆样CD8⁺T细胞池，表明肝内初级免疫应答诱发了一种独特的CD8⁺T细胞功能障碍程序。深入了解慢性HBV感染不同阶段的T细胞功能障碍程序，采取针对性策略恢复T细胞应答，有望治疗慢性HBV感染。

目前临床常用的抗病毒药物如核苷（酸）类似物［nucleos（t）ide analogues，NAs］可强效抑制病毒复制，改善肝脏炎症，但很少实现CHB治愈。它们对宿主免疫的影响暂未完全阐明。近些年，scRNA-seq用于CHB治疗干预后免疫相关的研究越来越多，对探索药物机制、预测疗效指标及优化治疗策略具有重要意义。

Jiang等［18］发现富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）治疗数年与未经治疗的HBeAg阴性患者相比，外周血免疫细胞亚群比例和基因表达差异无统计学意义。Li等 ［24］ 比较HBeAg阳性慢性HBV感染孕妇（从妊娠24周开始TDF治疗直至38～40周分娩）TDF治疗前后PBMC的scRNA-seq显示，治疗后T、B、NK细胞比例较前下降，单核细胞比例较前上升；但与健康孕妇相比，T细胞和单核细胞变化幅度较小。亚聚类分析显示，HBeAg阴性孕妇TDF治疗后CD4⁺T细胞和经典单核细胞比例增高。效应/记忆CD4⁺T细胞募集白细胞、炎症反应的相关基因和途径的表达、效应/记忆CD8⁺T细胞HBV复制的负调控因子通路、单核细胞HLA-DR和M1极化相关通路、NK细胞吞噬和细胞毒性相关途径表达均上调，揭示了HBV慢性感染孕妇使用TDF治疗后免疫状态恢复。Chua等［25］对TDF治疗4年的HBeAg阴性慢性HBV感染者［停药时HBV DNA阴性且丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）正常，停药4周时病毒反弹但ALT仍正常，停药后6～18周发生ALT异常升高和肝损伤］停药后0周和4周时纵向收集肝脏FNA肝组织进行scRNA-seq发现，2组间免疫细胞频率差异无统计学意义，但病毒反弹时I型IFN反应和巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的表达显著上调，而PBMC中未检测到上述基因表达的显著差异，表明HBV病毒学反弹后但尚未发生显著肝损伤之前，肝脏免疫已开始被激活，MIF可能作为停药后发生肝损伤风险的预测候选标志和治疗肝损伤的潜在靶点。Nkongolo等［26］对患有活动性肝损伤的CHB患者使用富马酸丙酚替诺福韦（tenofovir alafenamide fumarate，TAF）治疗，基线、12周、24周进行纵向肝FNA及scRNA-seq，发现活动性肝炎患者存在一种高度活化且组织驻留的多克隆CD8⁺T细胞亚群，效应分子［干扰素基因（IFNG）、Fas配体（FASLG）、颗粒酶（granzyme，GZM）A、GZMK］、趋化因子（CCL3、CCL4、CCL5）、活化标志物（TNFRSF9、CD38、HLA-DR、CD27、CD74）和耗竭标志物［PD-1、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immune receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT］高表达，命名为肝毒性CD8⁺T细胞。TAF治疗后，该细胞亚群的细胞频率及DEGs显著减少，与ALT水平正相关，表明TAF调节该细胞亚群是其改善肝脏炎症的免疫作用机制之一。Genshaft等 ［21］ 研究结果显示，ALT正常的HBeAg阴性患者，接受NAs治疗后HBV DNA转阴者与未接受治疗的HBV DNA阳性者相比，巨噬细胞的DEGs包括趋化因子［（chemokine C-X-C-motif ligand 3，CXCL3）、CCL3、CCL4］、细胞因子［白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、TNF］和ISG等表达下调，其余免疫细胞亚群的频数和基因表达无显著差异，这一结果表明未接受NAs治疗的HBeAg阴性CHB患者，尽管ALT正常，但HBV持续复制仍会引起肝内免疫激活，造成肝组织病变，为指南 ［27］ 建议降低ALT治疗阈值提供了免疫理论基础。而一项对接受NAs治疗的HBeAg阴性慢性HBV感染者PBMC中分选的CD8⁺T细胞进行scRNA-seq的研究 ［28］ 显示，HBsAg水平较高（＞100 IU/ml）组的细胞毒性评分显著高于HBsAg水平较低（＜100 IU/ml）组，且GO分析显示HBsAg水平较高组的基因仅在溶细胞途径中富集，表达较高的细胞毒性基因［GZMA、GZMB和穿孔蛋白1（perforin 1，PRF1）等］，而HBsAg水平较低组的基因在对病毒的防御反应、负调控病毒和病毒基因组复制等抗病毒途径中富集，表明细胞毒性较强的CD8⁺T细胞亚群频率升高可能不利于HBsAg的清除。而这一结论不同于前文中“AR通过强细胞毒性CD8⁺T细胞有效控制HBV感染”结论，分析其原因可能是该研究队列患者处于免疫控制期，与AR免疫状态不同，且未分析肝内免疫特征，具有一定局限性。由于长期NAs治疗下HBeAg阴性且未获得HBsAg清除的患者居多，后续对该研究的结论进行验证具有一定的临床价值。

聚乙二醇干扰素（pegylated-interferon，PEG-IFN）作为免疫调节剂，同时具有免疫调节和抗病毒能力，与NAs作用机制不同。Jiang等 ［18］ 对PEG-IFN-α治疗48周前后的PBMC进行scRNA-seq发现，治疗后Pro-infla CD14⁺和CD16⁺单核细胞频数减少、促炎基因表达下降，而特异性的IFN-sti CD14⁺单核细胞增加、与抗原呈递相关基因的表达增加，且细胞通讯分析发现PEG-IFN-α增强了与抗原呈递相关的病毒识别相关基因和人类白细胞抗原家族成员的表达，表明IFN-α既减轻炎症，还增强了病毒抗原递呈过程，激活先天免疫反应，产生强大的抗病毒作用。Zhong等 ［29］ 纵向收集HBeAg阳性CHB患者接受PEG-IFN-α治疗第0、4和12周的PBMC进行scRNA-seq发现，PEG-IFN-α诱导T细胞向效应/记忆亚群分化，T、B细胞中参与免疫效应过程、细胞因子相关反应等的DEGs显著上调，与Jiang等 ［18］ 研究结果一致，表明PEG-IFN-α治疗可恢复CHB患者T、B细胞数量和功能障碍。此外，IFN-α通过增强B细胞的抗原呈递功能和共刺激分子对相互作用来增强T-B细胞连接，以B细胞依赖的方式增强保护性的HBV特异性细胞免疫，表明B细胞可能是IFN-α诱导细胞免疫的有效辅助因子，靶向“IFN-α-B-T细胞”轴的联合疗法是潜在的一种治疗手段。最近，Wang等 ［30］ 构建了能真实应答人IFN-α刺激的人源化I型IFN受体（humanized IFN receptor，hulFNAR）小鼠模型，使用PEG-IFN-α治疗15周后，对其肝组织行scRNA-seq发现，髓细胞、中性粒细胞增加、NK/T和B细胞数量减少。与安慰剂组相比，IFN-α增强了单核细胞的抗原呈递功能、共刺激分子表达、增殖活性等，上调了CD8⁺T细胞的白细胞黏附、激活和T细胞受体信号传导等功能，有效地降低了小鼠的HBsAg。而Narmada等 ［31］ 使用scRNA-seq首次深入探索了CHB患者获得临床治愈（大部分患者为IFN+NAs实现临床治愈）后的肝内免疫环境，为临床治愈潜在机制提供了新见解。研究发现相比于CHB患者，临床治愈者肝脏中的适应性和先天免疫细胞组成显著改变，具体表现为肝内T细胞显著减少、NK细胞及中性粒细胞增多，且PBMC中无上述趋势，表明肝脏免疫细胞状态并不总是反映在外周循环中。肝脏中耗竭CD8⁺T细胞和Treg细胞减少、耗竭标志物显著降低，而一群表达与效应细胞毒性淋巴细胞相关标志物（PRF1、GZMA、GZMK等）的CD4⁺T细胞明显增多，且这些改变与qHBsAg的降低相关。表明临床治愈患者肝内环境从免疫抑制状态转变为免疫激活状态。这些改变提示我们应用免疫调节剂调节先天性及适应性免疫应答，可能促进临床治愈的实现。

上述研究运用scRNA-seq技术分析CHB多种抗病毒药物治疗干预前后免疫细胞的转录组变化，揭示了关键细胞类型、基因及信号通路的恢复情况，有助于探索预测疾病预后的指标和发掘新的治疗手段。但如何提高现有抗病毒治疗方案的疗效，提高临床治愈率仍是临床亟需解决的重、难点问题。未来仍需要进行更多不同治疗干预下CHB患者的纵向研究，以及同种治疗干预下实现临床治愈及未实现临床治愈群体的队列研究，以推动对乙型肝炎临床治愈机制的深入理解，为CHB的治疗提供新的参考。

本文综述了scRNA-seq技术应用于CHB疾病进展及治疗干预中免疫细胞类型、细胞发育轨迹、细胞互作网络等的认识，为进一步理解CHB的发病机制、优化治疗策略打下了坚实基础。未来深入研究上述具有抗病毒潜力的异质性细胞亚群的功能特征及其作用机制，有助于开发新型抗病毒药物。但现有研究也存在数据挖掘不足、样本量较小等缺陷，上述预测候选指标、潜在治疗靶点仍有待进一步探索及验证。未来，对不同疾病阶段、不同药物治疗干预的CHB患者进行更大样本量的验证实验，并联合基因组、蛋白质组、代谢组等多组学能提供更全面的免疫信息，多维度阐述疾病发生和发展规律，将提高我们对CHB发病机制和药物治疗机制的理解。