Y187-pHis2系统酵母单杂筛库

产

品

组

成

注：

1. 本试剂盒可用于一次诱饵筛库实验（质粒除外）。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80 ℃保存。

3. 规格0.5 L×2表示：2个包装，每个包装0.5L；规格5×1 mL表示：1个包装，含5个1 mL。

4. 对照菌株的最佳3-AT浓度参考网站菌株说明书。

5. 感受态细胞CC308配带有Carrier DNA和PEG/LiAc。

实

验

方

法

一

实验耗材与试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm培养皿，备用。

2. Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

4. 自备0.9%生理盐水，可用ddH2O无菌水代替，备用。

5. 普通平板制备

将1条培养基溶于0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4 ℃冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm），或70-75 mL/块倒平板（Φ150 mm），凝固后4 ℃冰箱保存。

6. 特殊平板制备

SD/-His/-Leu/-Trp with Agar（3-AT）：将一条SD/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，参照表1加入3-AT，倒平板25 mL/块（Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。

二

菌株使用与保存

1. 挑取甘油保存的对照菌液（10-50 μL）于SD平板上划线，28-30 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2. 挑取上述单菌落于SD液体培养基中，200 r/min、28-30 ℃振荡培养2 d，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。

注：Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和Y187[p53-His2+pGADT7]用SD/-Leu/-Trp培养基，Y187[p53-His2]用SD/-Trp培养基。

三

实验步骤

对于Y187-pHis2系统酵母单杂筛库，常用的方法有两种：

a. 先将诱饵质粒转进酵母Y187，做诱饵质粒自激活，再将诱饵质粒和文库质粒共转到同一种酵母Y187。

b. 先将诱饵质粒转进酵母Y187，做诱饵质粒自激活，再将诱饵菌株制备成感受态后将文库质粒转入。

根据实验条件和操作习惯选择一种方法即可，只要操作和BD构建没有问题都不会影响筛库的效率，实验流程差异只在于3.3制备Y187[pBait-His2]感受态与筛选cDNA文库，本方案为第一种。

3.1 构建诱饵酵母菌株（pBait-His2转化Y187）

1. 取100 µL冰上融化的Y187感受态细胞（货号：CC306），依次加入预冷的质粒5 μL（2-5 µg），Carrier DNA 10 µL（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。

4. ddH2O 50 µL重悬，涂板SD/-Trp平板，30℃培养3-5 d。

注：同时将Y187阳阴性菌株于SD平板划线活化。

5. （可选步骤）PCR鉴定阳性克隆。详细步骤可参考酵母阳性克隆快速检测试剂盒（货号：SK2420），本试剂盒包含猎物AD引物，诱饵BD引物可根据实际情况设计。

3.2 筛选诱饵酵母菌株的3-AT最佳使用浓度

对于不同的诱饵片段，其3-AT最佳使用浓度不同，因此，需要筛选每个诱饵酵母菌株的3-AT最佳使用浓度，具体步骤如下。

1. 上述的转化验证成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于1 mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD600调至0.002（也可以用SD/-Trp液体培养基培养至OD600=0.002）。

2. 取100 μL菌液分别涂布到SD/-Trp平板和含不同3-AT浓度的SD/-His/-Trp平板上，30 ℃培养2-3 d；

3. 观察诱饵酵母在不同3-AT浓度平板上生长状况，从而确定3-AT最佳使用浓度。

注：在不同浓度3-AT平板上（0，10 mM，20 mM，30 mM，40 mM，50 mM，60 mM，70 mM，80 mM），出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为3-AT最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下筛库自激活3-AT浓度不宜超过80 mM。

3.3 制备Y187[pBait-His2]感受态与筛选cDNA文库

酵母菌株Y187含有Leu2-3基因，在生理状态下该基因处于抑制状态，不能合成亮氨酸，所以诱饵酵母菌株不能在缺亮氨酸的培养基（SD/-Leu）上生长。文库cDNA载体pGADT7含有LEU2基因，当文库质粒成功转入诱饵酵母菌株时，诱饵酵母能够在缺亮氨酸的培养基（SD/-Leu）上生长。当文库中的猎物蛋白与诱饵片段互作时，激活选择报告基因His的表达，从而互作的酵母菌株能够在SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*培养基上正常生长。

1. 挑取鉴定成功的Y187[pBait-His2]单菌落接种到含有3 mL SD/-Trp液体培养基的15 mL摇菌管中。30 ℃，200 rpm过夜培养。

2. 将3 mL小摇菌体（上步小摇所得）接到含有50 mL液体SD/-Trp培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000 rpm离心5 min，弃上清。

3. 用10 mL Y1溶液重悬沉淀，3000 rpm离心5 min，弃上清。

4. 加入600-1000 μL Y2溶液重悬，转文库按600 μL分装，转质粒按100 μL分装，可直接用于转化或冷冻保存。

注：制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。

5. 取上述Y187[pBait-His2]感受态细胞600 µL于冰上，依次加入预冷的15 μg cDNA文库质粒（约30 μL）、2520 μL Y3溶液，轻柔吸打混匀，30 ℃水浴90 min (每10 min时翻转6-8次混匀)。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过3小时。

注：文库质粒加入量与文库质量有关，可根据实际情况加入。建议用ddH2O补充体积，将质粒与Y3溶液的体积定容为2.6 mL。

6. （可选步骤）用3 mL YPD Plus Liquid Medium重悬沉淀，30 ℃摇床震荡培养90 min，3000 rpm离心5 min，弃上清。

7. 3000 rpm离心5 min，弃上清。加入15 mL 0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板。

注：上述为酵母大规模转化，将文库质粒转化进诱饵酵母菌株中；同时做小规模转化，将pGADT7和pGADT7-53转化Y187[p53-His2]作为阴、阳对照，均涂布在SD/-Leu/-Trp。本是试剂盒已包含阴阳性对照菌，在相应的培养基上划线培养即可。

8. 取上一步的50 µL重悬菌体，按1/10、1/100、1/1000比例稀释，各取100 μL菌液于SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp三种平板（Φ90 mm）涂布。

9. 剩余重悬菌体，每150 μL涂布于SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*平板（Φ150 mm）。

注：总共15 mL，每板150 μL可涂布100块。每板可以适当增加重悬菌体量，减少平板数量，建议35-100块平板（Φ150 mm）。与自激活浓度相比，筛库3-AT*浓度应高出5 mM，且在50-100 mM之间。

10. 30 ℃培养3-5 d，统计SD/-Leu/-Trp (Φ90 mm)平板上单菌落数目，计算文库筛选克隆数。

文库筛选克隆数= [cfu/mL on SD/-Leu/-Trp]×[稀释倍数]×[重悬体积 (15 mL)]

转化效率=克隆细胞数×悬浮体积（mL）×稀释倍数×[涂板子体积（mL）×总DNA的量（μg）]^-1

注：SD/-Leu/-Trp平板上，至少要有1.0×10⁶个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。SD/-Leu/-Trp/3-AT*平板上克隆数非常少，往往与诱饵序列和文库质量有关。有研究表明30万个克隆也能筛选到阳性克隆。

3.4 筛选阳性克隆

1. 复筛活化菌株

（可选步骤）将筛选得到的单菌落于SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*平板划线，2-4 d能够生长的菌落再用于后续验证。

2. 菌落PCR鉴定互作酵母菌株

选择直径约为2~3 mm的克隆，菌落PCR扩增，引物为pGADT7-F/R，PCR体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒（货号：SK2420）。

3. 复筛鉴定互作酵母菌株

电泳条带大于400 bp（根据实验目的和实际情况而定）的单菌落，划线于SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*培养基上，30℃培养2-4 d。有多条电泳条带的单菌落（含有多个质粒的转化子），需要在SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*筛选培养基上重复划线培养2-3代，然后通过菌落PCR的方法选出具有单个质粒的克隆。

3.5 互作克隆鉴定

互作克隆鉴定也称点对点互作验证或回转验证。在回转验证实验中，AD载体有两种形式，文库质粒或互作基因CDS片段重新构建pGADT7质粒，都可以用于验证实验。可以参考本公司的Y187-pHis2系统酵母单杂筛库试剂盒，这里仅做简要描述。

将上述PCR产物送公司测序，使用BLAST序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，根据测序和序列比对结果，将与数据库中转录因子同源性高的阳性克隆的文库质粒，提取质粒后重新转化Y187[pBait-His2]菌株。或通过NCBI在线Blast分析转录因子CDS，然后根据其对应的引物，以cDNA为模板（建库时的cDNA），扩增转录因子全长，重新构建pGADT7载体，并转化Y187[pBait-His2]菌株。

3.5.1 文库质粒回转验证

1. 用SD/-Leu/-Trp液体培养基摇阳性酵母克隆菌株，离心收集菌体并提取文库质粒。如果阳性克隆超过60个，方法参见96孔一步法酵母质粒小提试剂盒（货号：PE056）；如果阳性克隆少于60个，方法参见一步法酵母质粒小提试剂盒（货号：PE055）。

2. 从酵母中提取的文库质粒转入E.coli感受态细胞，转化液全部涂布在含Amp的LB培养基上，37℃培养16 h。每个样品取3-5个克隆（重复）进行菌液PCR鉴定。

3. 挑取鉴定成功的单菌落摇菌，提取大肠杆菌中的文库质粒，方法参见质粒小提试剂盒（PE035）。

4. 将提取的文库质粒转入诱饵酵母菌株Y187[pBait-His2]为实验组，pGADT7空转入Y187[pBait-His2]为对照组，可以更好的体现实验组是否互作。文库质粒转入Y187[Mutant Bait pHis2]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略如表2 表3。

5. 文库质粒转化诱饵菌株，快速离心转化液，0.9%的氯化钠溶液分别悬浮转化菌体，涂布SD/-Leu/-Trp培养基上，30℃培养3-5 d。

6. 取转化后的重组子菌落，重悬于0.9%的氯化钠溶液中，将OD600调至0.2、0.02、0.002、0.0002。分别取100 μL菌悬液涂布于SD/-His/-Leu/-Trp/3-AT*和SD/-Leu/-Trp培养基上，30℃倒置培养3-5 d，观察菌落生长情况，如表2 表3。

上述为涂板法验证酵母杂交互作，梯度稀释点板法可参考本公司的Y1HGold单杂互作验证试剂盒。

7. 将转化后的重组子酵母进行PCR、测序、比对分析（或提取质粒、PCR、测序、比对分析），方法同上。

3.5.2 转录因子全长重新构建pGADT7载体回转验证

以cDNA为模板（建库时的cDNA），扩增转录因子全长，重新构建AD-Prey（pGADT7-Rec2载体），并转化Bait菌株。方法同上，验证结果如表2 表3。

四

注意事项

（一）载体注意事项：

1. 建议收到质粒后请先转化感受态（克隆菌株），再挑选单菌落重新提取后使用。

2. 转化前请准确查找该质粒对应的抗生素、抗生素浓度、感受态（克隆菌株）和培养温度。

3. 如有必要请测序后使用，我司网站检索对应货号可下载质粒图谱。

（二）培养基注意事项：

1. 一般情况下pH值不必调节，建议测定一下pH 5.8±0.2即可。

2. SD培养基可能溶解不彻底或灭菌后有少量沉淀，不影响实验进行。

3. SD培养基灭菌后，颜色为白色至浅黄色。

（三）感受态注意事项：

1. 一支感受态不建议分成两份使用。

2. 如果转化效率低，只有几个单克隆，建议做PCR鉴定。

3. 筛选出来的单克隆，一般是圆形凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明、乳白色-浅黄-浅粉色的菌落，有酵母气味。

（四）本试剂盒注意事项：

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。

总

结

酵母单杂互作验证实验常用系统有Y1HGold-pAbAi、Y187-pHis2和EGY48-LexA，每个系统的使用方法有较大差异。根据大量实验经验，本公司为大家提供一个优化的Y187-pHis2系统酵母单杂筛库方案，可以大大减少实验时间。如果各位朋友需要使用Y187-pHis2系统，那么本方案是一个较好的选择。在酵母单杂实验中，如果Bait有较强的自激活现象，我们更推荐Y1HGold-pAbAi系统，Y1HGold报告基因为AbAr，不仅可以很好的抑制诱饵自激活，而且能大大降低酵母单杂假阳性的概率。更多问题解答，可联系本公司。

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