CRISPR/Cas系统是一种强大的基因组编辑工具，在分子诊断、治疗和基因工程领域有着广泛的应用。传统的CRISPR/Cas系统中，单个Cas-CRISPR RNA（crRNA）双链体靶向目标核酸的单个区域。目标核酸在溶液中的构象会影响其与Cas-crRNA复合体的结合效率，而具有许多碱基对的目标核酸往往会堆积并覆盖大量的结合位点，从而导致CRISPR/Cas系统的识别和剪切效率显著下降。因此，迫切需要设计出一种能够克服现有CRISPR/Cas系统在剪切效率方面局限性的系统。
近日，复旦大学魏大程团队提出了一种CRISPR/Cas协同剪切（CRISPR-CS）平台。与传统的CRISPR/Cas系统相比，两组CRISPR/Cas-crRNA复合体同时识别目标序列中的不同位点，提高了识别可能性与剪切效率。CRISPR-CS平台在以猴痘、人乳头状瘤病毒和肌萎缩侧索硬化症为代表的传染病、癌症以及遗传病检测中的准确率高达98.1%，证明了CRISPR-CS系统的潜在应用价值。
图1. CRISPR-CS系统的工作原理。(a)常规CRISPR/Cas12a剪切系统和CRISPR-CS系统的反应原理。(b)剪切及测试过程示意图。
CRISPR-CS系统利用两组Cas12a-crRNA复合物有效地与目标DNA上的不同位点结合，形成三核螺旋复合物，激活Cas12a酶的裂解活性。在部分折叠的靶标序列中，一旦靶向位点被覆盖，传统系统中的Cas12a-crRNA复合物将无法与靶标结合，而CRISPR-CS系统的Cas12a-crRNA复合物仍然具有很高的识别概率(图1a)。与传统的CRISPR/Cas系统相比，在不同位点协调使用两种复合体显著提高了与靶DNA的捕获和结合效率，增强了协同剪切效应。协同剪切可在电极上剪切更多的报告分子，使非扩增核酸电化学检测在5分钟内完成 (图1b)。作者还通过机器学习确定了最优阈值，以提高诊断准确性，而后根据电信号和阈值获得诊断结果。
图2. 使用CRISPR-CS系统进行临床样本检测。(a)通过PCR和CRISPR-CS检测临床样本流程对比。(b)稀释度为10%至90%的临床样本中的电信号响应。(c)阳性临床样本与阴性对照样本的电信号比较。(d)用于CRISPR-CS测试和验证的ROC曲线。(e)使用支持向量机(SVM)对临床样本进行混淆矩阵分析。
该工作克服了由于靶序列折叠而导致的剪切效率低的缺点，可直接检测未扩增的临床样品，与临床结果高度吻合。除了核酸检测之外，CRISPR-CS还有许多其他潜在的应用。例如，CRISPR-CS可以传递到特定的细胞、组织或器官，以进行有效的靶向基因编辑。将CRISPR-CS系统应用于内源染色体成像可以减少过多的背景信号等。
论文信息
An Efficient CRISPR/Cas Cooperative Shearing Platform for Clinical Diagnostics Applications
Junhong Zhao, Dr. Derong Kong, Prof. Guanghui Zhang, Shen Zhang, Yungen Wu, Dr. Changhao Dai, Yiheng Chen, Yuetong Yang, Prof. Yunqi Liu, Prof. Dacheng Wei
该论文的第一单位为复旦大学高分子科学系聚合物分子工程国家重点实验室。复旦大学博士研究生赵俊虹为第一作者。复旦大学魏大程研究员和孔德荣博士为共同通讯作者。
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202411705
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