外排泵介导的药物耐药是癌症化疗和其他小分子治疗中的一个重大挑战，外排泵抑制剂与抗癌药物联合使用是一种很有前景的化疗策略。ATP 结合盒式蛋白(ABC)家族包含多种外排泵，它们介导了多种药物的耐药性。比较常见的如P-糖蛋白（P-gp或ABCB1）会阻碍药物的细胞摄取，或多药耐药蛋白家族（MRPs或ABCC）会外排不同结构特征的多种药物。鉴定某种药物具体由哪些外排泵所排出至关重要，但却充满挑战。主要原因是不同外排泵的底物数量众多且结构迥异，例如MRP1 (ABCC1)可以泵出数百种不同结构的药物，包括抗癌药物长春花碱和重金属阴离子；同时一些药物可能是多个泵的底物，如黄芩苷，它同时由MRP3和MRP4运输。这使得通过结构预测来判断药物是否为特定外排泵的底物十分困难，同时也缺乏高通量筛选手段在活细胞中鉴定可被特定外排泵排出的小分子药物。因此，我们迫切需要一种通用可靠的方法，可以在活细胞中判断特异性MRPs的药物外排。
针对以上问题，清华大学药学院秦为课题组、北京大学化学与分子工程学院王初课题组和陈兴课题组联合在Angewandte Chemie International Edition杂志上发表了题为“Chemical recording of pump-specific drug efflux in living cells”的研究论文。该研究开发了一种化学生物学新技术BRIEF(bioorthogonal reporter inhibiting efflux，BRIEF)，利用化学探针在活细胞中记录特定外排泵的药物外排过程，为理解药物耐药性提供了新的视角。
BRIEF通过设计一种生物正交外排探针(BEP)来指示药物的外排情况。目标药物如和BEP通过相同泵，即会导致外排竞争，从而增加细胞内BEP浓度。由于BEP具有细胞内蛋白反应活性，浓度增加即会增加细胞内的蛋白质标记强度。通过对细胞裂解物进行点击化学反应偶联荧光基团，可以通过凝胶内荧光检测判断细胞内BEP水平。通过这种方法可以实现特定外排泵的底物筛选检测。
为了验证BRIEF的可行性，首先需要发展特异的BEP探针。作者首先关注到了全乙酰化非天然糖探针（如Ac4GlcNAl），这类探针被广泛应用于糖质代谢标记研究糖基化的生物学功能。乙酰化保护显著提高了非天然糖探针的疏水性和细胞膜通透性，但近年来也发现乙酰化保护造成了非天然糖探针与半胱氨酸的副反应。由于此类疏水探针可能是外排泵的潜在底物，同时又具有特异的胞内蛋白反应活性，作者首先探究了全乙酰化非天然糖探针成为BEP的潜力。以Ac4GlcNAl探针为例，作者利用不同泵的抑制剂共处理细胞，发现ABCC家族的抑制剂MK-571显著提高了Ac4GlcNAl的标记信号。这表明Ac4GlcNAl主要通过ABCC亚家族排出，因此作者分别敲低了ABCC的不同外排泵，发现了负责其外排的外排泵为ABCC3，4，10和12，因此Ac4GlcNAl可以作为这些外排泵的BEP探针。
作者进一步基于BRIEF建立小分子药物的外排筛选平台，对409种天然产物的外排情况进行了筛选鉴定， 从而发现了单宁酸、没食子酸和胆固醇这三种天然小分子可以由ABCC外排泵所排出。其中单宁酸对Ac4GlcNAl标记信号的提高最为明显，因此作者进一步验证了ABCC的抑制剂是否可以增强单宁酸的药用活性。单宁酸已知具有抑制癌细胞增值和抗SARS-COV-2的活性，作者发现结合ABCC抑制剂MK-571处理，可以显著提高单宁酸的抑癌活性和抗SARS-COV-2的活性。
作者最后验证了BRIEF策略的普适性，发展了针对P-gp（ABCB1）外排泵的BEP探针。罗丹明123已知可以被ABCB1外排，同时它具有光催化邻近标记的反应活性。作者因此选用罗丹明123作为ABCB1的BEP探针，并同样进行了活细胞内的底物筛选，发现了二氢茉莉酸甲酯作为新的P-gp底物，证明了BRIEF策略的普适性。总结而言，BRIEF方法提供了一个通用的、可扩展的活细胞筛选平台，通过对细胞内蛋白质的化学标记来监测药物外排情况。
论文信息
Chemical Recording of Pump-Specific Drug Efflux in Living Cells
Xuege Sun, Dr. Ying Chen, Chen Yang, Dr. Song Yang, Dr. Wei Lin, Dr. Baiyi Quan, Xuanzhen Pan, Prof. Dr. Qiang Ding, Prof. Dr. Xing Chen, Prof. Dr. Chu Wang, Prof. Dr. Wei Qin
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202409282
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