温故知新​|缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织细胞红蛋白的表达

学术   科学   2024-07-03 17:01   北京  

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本文发表于《中华围产医学杂志》2010年第1期
引用格式:郑淮武,史雪川,庄静文,等. 缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织细胞红蛋白的表达[J]. 中华围产医学杂志,2010,13(01):37-40. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2010.01.011

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郑淮武 史雪川 庄静文 杨汉华 陈思红 
基金项目:广东省科技计划项目(社会发展类别 2008B080701036);广东省医学科研基金立项(B2009180) 
作者单位:515041 汕头大学医学院第二附属医院儿科[郑淮武(现在广东省深圳市第八人民医院儿科)、 史雪川、庄静文、杨汉华、陈思红] 
通信作者:史雪川







【摘 要】


目的   探讨细胞红蛋白(cytoglobin,CYGB)在 7 日龄新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)脑内的表达变化。 

方法  健康7日龄SD大鼠70只,按简 单随机抽样法随机取50只制备 HIBD 模型作为 HIBD 组,再随机分为 HIBD 后0、4、12、24和48h 组,每组10只;假手术组10只,只分离左颈总动脉,不结扎,也不放入缺氧箱;另10只不做任何处理 作为对照组。假手术组术后即断头取脑,对照组同时取脑,HIBD组在相应时间点取脑。采用免疫组 织化学法和 Western印迹法从蛋白水平分析 CYGB在脑组织中的分布及表达特点。 

结果  (1)免疫组织化学染色显示 CYGB主要表达于大脑皮质、丘脑和海马神经元的胞浆,HIBD 组 CYGB表达 数量及染色强度均高于对照组,其中缺氧24、48h组表达最强。(2)Western印迹结果显示,HIBD 后 0、4、12、24和48hCYGB 平均吸光度分别为261.5±5.0,263.0±5.4,464.3±6.8,522.8±11.2, 512.9±7.9,明显高于假手术组(117.6±7.0)及对照组(116.6±9.0),P<0.01。其中缺氧0和4h 组明显高于对照组(P<0.01);缺氧12h组的表达明显高于缺氧0、4h组(P<0.01);缺氧24、48h 组明显高于缺氧12h组(P<0.01);缺氧0、4h组间,缺氧24、48h组间差异无统计学意义(P> 0.05)。 

结论   7日龄新生大鼠 HIBD后脑内 CYGB表达明显增强,并且随着缺氧缺血发展呈现时 相性变化,提示其可能在脑缺氧缺血的适应性调节过程中起重要作用。

【关键词】珠蛋白类;缺氧缺血,脑;大鼠,Sprague-Dawley 




人脑质量只有人体质量的2%,但其耗氧量却高达人体总耗氧量的20%,因此脑是对缺氧最敏感 的器官。近年研究相继发现了携氧球蛋白家族的两 个成 员———脑红蛋白和细胞红蛋白 (cytoglobin, CYGB),脑红蛋白在脑内分布广泛,且具有保护缺 氧缺血脑组织免受损伤的作用[1]。CYGB同样在脑 内分布广泛,是单节显性蛋白,分子量为21406Da, 有190个氨基酸残基,蛋白核心区域与脑红蛋白相 似,主要是经典的“three-over-three”α-螺旋三明治 折叠结构[2-3]。这一结构被认为是 CYGB携氧运氧的结构基础,提示 CYGB 的表达与缺氧关系密切。目前有关 CYGB 在缺氧缺血性脑损伤 (hypoxicischemic brain damage,HIBD)中的变化的体内实验较少,本研究通过检测 CYGB在新生7日龄大鼠脑缺氧缺血急性期的表达情况,探讨 CYGB在脑缺氧缺血早期的表达规律。

材料与方法 
一、新生大鼠 HIBD模型的制备及分组 
健康 7 日 龄 SD 大鼠 70 只,雌雄不拘,体重 12.5~18.0g,由汕头大学医学院实验动物中心提供。根据简单随机抽样法随机取50只新生大鼠制备 HIBD模型作为 HIBD组,方法如下:乙醚麻醉后取颈正中切口分离并以6-0丝线结扎左颈总动脉两端并从中间剪断,手术后将新生鼠放回母鼠身边休息2~3h,后置缺氧舱中,以 1L/min 速度注入 92%氮气与8%氧气的混合气体,2h后将鼠取出, 放回母鼠身边喂养,再随机分为 HIBD 后0、4、12、 24和48h组,每组10只,按各个时间点断头取脑。假手术组10只,只分离左颈总动脉,不结扎,也不放入缺氧箱,另10只不做任何处理作为对照组。假手术组术后即断头取脑,对照组同时取脑。
二、研究方法 
1.脑组织 CYGB表达情况:采用免疫组织化学方法检测。各组大鼠在相应时间点断头取脑,在正中线上将脑组织矢状切开置4%多聚甲醛固定12~ 24h,常规脱水及石蜡包埋,脑组织按矢状切面平行方向行连续4μm 切片,间隔100μm 取一层。切片常规脱蜡至水,3% H2O2 室温孵育15 min; 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)抗原修复; 正常兔血清室温封闭20min,滴加多克隆山羊抗鼠一抗(SantaCruz公司)(1∶200)4 ℃过夜;滴加辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗(SantaCruz公司) (1∶400)37 ℃孵育30min;DAB(试剂盒购自北京中山生物技术有限公司)显色,苏木素复染。镜下观察,细胞内(包括细胞质及细胞核)呈棕黄色者为阳性细胞。
  2.脑组织 CYGB 的半定量检测:采用 Western 印迹法。各组大鼠在各时间点断头取脑,置于细胞裂解液中,冰上匀浆30 min,4 ℃ 12000×g 离心 10min,取上清液-30 ℃保存。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取20μg蛋白95 ℃变性10 min。电泳、转膜,5% 脱脂奶粉常温封闭 1 h。一抗 (1∶200)4 ℃过夜。洗膜5min×3次,换塑料袋加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000),37 ℃水 平摇床孵育 1h。洗膜 3 次,化学发光底物孵育 1 min,硝酸纤维素滤膜暗室感光,拍照。用Image ProPlus5.0软件系统分析图像,Western印迹各条带与同一膜上对照组第一泳道上的条带进行比较形成相对灰度,读取数据,以吸光度表示。 
三、统计学分析 
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用 SPSS 13.0统计软件行单因素方差分析,采用 SNK 法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。 

结 果
  一、免疫组织化学法检测脑内CYGB的表达变化
  HIBD组各时间点切片免疫组化染色均有显色,阳性细胞主要定位于细胞质,突起中亦有少量着色。大脑皮质 CYGB 分布广泛,细胞相对密集。海马各区(CA1~CA4)均有阳性分布,阳性细胞主要为锥体细胞,在锥体细胞层外的其他海马区也有稀疏的阳性细胞。丘脑中 CYGB 的阳性神经细胞呈散 在分布,密度和显色强度小于皮质和海马。HIBD0、4h组较假手术组和对照组染色深、表达量多,而 HIBD 12、24、48h 组 CYGB 染色进一步加深,表达数量明显增多。其中 HIBD 24、48h最强。见图1~3。
 二、Western印迹法检测脑内CYGB的半定量结果 
对照组CYGB平均吸光度为116.6±9.0,假手术组为117.6±7.0,HIBD 0、4、12、24和48h组分别为261.5±5.0,263.0±5.4,464.3±6.8, 522.8±11.2,512.9±7.9。其中 HIBD 0、4h组明显高于对照组,差异有统计学意义(t分别为52.723, 51.893,P<0.01);HIBD 12h组的表达明显高于 HIBD 0、4h组(t分别为75.749,74.165,P<0.01), HIBD 24、48h组明显高于 HIBD 12h组(t分别为 17.653,14.740,P<0.01),HIBD0、4h组间,24、48h 组间差异无统计学意义(P>0.05)。对照组与假手术组间差异无统计学意义(P>0.05)。 


讨 论
  CYGB是继脑红蛋白之后发现的第4种携氧球蛋白。CYGB在体内各器官组织包括肝、脑、心、肾、 脾、胃肠、骨、软骨、肺、气管、肌肉等都有不同程度的表达。即使是在胚胎组织也可见到少量表达,在胚胎后阶段主要表达于中枢神经系统及神经管嵴衍生物,因此 CYGB 也有组织红蛋白之称[4]。Geuens 等[4]发现 CYGB在大鼠中枢神经系统内分布广泛, 杏仁核、尾状核、小脑、大脑皮层、额叶、海马、延髓、 枕极、黑质、聂叶、丘脑、下丘脑核和脊髓均有表达。本研究表明,无论在常氧或缺氧条件下,CYGB在海马、丘脑和皮质均分布广泛,特别是缺氧时,CYGB 的表达更强。海马、丘脑和下丘脑这三个区域是对缺氧应激能够迅即感应的部位,表明 CYGB可能在缺氧的适应性调节过程中起重要作用。与 Geuens 等[4]认为 CYGB在脑内主要表达于细胞核不同,本研究结果显示脑内 CYGB主要分布于细胞质中。 
本研究发现,HIBD 组 CYGB的表达较对照组明显增强,表达的高峰期在 HIBD24、48h这个时段。升高的意义可能在于帮助细胞从细胞外获取氧,并将氧传递给线粒体,这可能是 CYGB 在缺氧状态下保护细胞的作用机制之一[5]。从本研究看, CYGB广泛存在于对缺氧较为敏感的丘脑、皮质、海 马部位,缺氧时表达明显增强,预示其在缺氧后脑损伤中起重要作用,CYGB贮存氧的释放可能在一定程度上延缓缺氧导致的神经细胞死亡。有趣的是, 学者们发现相对低级的无尾两栖类动物体内心肌及骨骼肌细胞缺乏肌红蛋白,而肌细胞内的 CYGB 取代肌红蛋白,主导了氧的储存及运输[6],这也是 CYGB可以在缺氧下保护组织免遭损伤的证据之一。但缺氧诱导 CYGB 表 达的机制目前尚未明了。
  总之,本研究结果表明,随着脑缺氧缺血的发生发展,CYGB在蛋白水平的表达呈现时相性递增的变化,即在脑缺氧缺血后增强,表明其可能在脑缺氧的适应性调节过程中起重要作用。CYGB的发现为脑缺氧缺血的发病机制以及防治研究指出了新的方向, 随着对CYGB研究的进一步深入,定会给脑损伤的早期检测、早期干预以及后期的康复带来新的思路。 



参考文献
 


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