Y187-pHis2系统酵母单杂互作验证
产品简介
酵母单杂互作验证实验常用系统有Y1HGold-pAbAi、Y187-pHis2和EGY48-LexA，每个系统的使用方法有较大差异，本期我们以Y187-pHis2为例进行分析。根据Coolaber公司的大量实验经验，为大家提供一个优化的Y187-pHis2系统酵母单杂互作验方案（货号：YH1011），本方案分为三个主要步骤：Bait和Prey共转化Y187，阳性克隆鉴定，互作验证，方案中有较详细的实验流程。此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析，有需要的读者建议读到最后哦。
产品组成
注：
1. 本试剂盒可用于10对单杂互作验证（质粒除外）。
2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。
3. 0.5 L×2表示：2个包装，每个包装0.5 L；5×1 mL表示：1个包装，含5个1 mL。
4. 对照菌株的最佳3-AT浓度参考网站菌株说明书。
5. 本方案不适用大批量酵母单杂交实验，因为诱饵自激活检测和毒性验证应该预先完成。
实验方法
一、实验耗材与试剂
二、菌株使用与保存
三、实验步骤
四、互作验证分析
一
实验耗材与试剂
本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在Coolaber公司单独购买。
1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm培养皿，备用。
2. Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。
4. 自备0.9%生理盐水，可用ddH2O无菌水代替，备用。
5. 普通平板制备
将1条培养基溶于0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4 ℃冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm），凝固后4 ℃冰箱保存。
6. 特殊平板制备
SD/-His/-Leu/-Trp with Agar（3-AT）：将一条SD/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，每25 mL固体培养基，按照表1加入3-AT，混匀倒平板25 mL/块（Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。
表1 不同浓度3-AT平板
二
菌株使用与保存
1. 挑取甘油保存的对照菌液（10-50 μL）于SD平板上划线，28-30 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。
2. 挑取上述单菌落于SD液体培养基中，200 r/min、28-30 ℃振荡培养2 d，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。
注：Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和Y187[p53-His2+pGADT7]用SD/-Leu/-Trp培养基，Y187[p53-His2]用SD/-Trp培养基。
三
实验步骤
3.1 Bait和Prey共转化Y187
AD-Prey、AD- Empty、pBait-His2、p53-His2和Mutant Bait pHis2）测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。
1. 取100 µL冰上融化的Y187感受态细胞（货号：CC306），依次加入预冷的质粒Bait和Prey（各1-2 µg），Carrier DNA 10 µL（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。
4. ddH2O 50 µL重悬，涂板SD/-Leu/-Trp平板，30 ℃培养3-5 d（同时，将Y187阳阴性菌株于SD/-Leu/-Trp平板划线活化）。
5. 实验组和对照组的设置参考表2。
表2 共转化的实验组和对照组
注：对照组1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组2**诱饵菌株建议是Y187[Mutant Bait pHis2]，不可以是Y187[Empty pHis2]，以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略。
3.2 阳性克隆鉴定
此步骤可以省略。详细步骤可参考SK2420酵母阳性克隆快速检测试剂盒，本试剂盒包含猎物AD引物，诱饵BD引物可根据实际情况设计。
3.3 互作验证
1. 上述的转化成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于1 mL 0.9% NaCl无菌水中重悬，OD600调至0.2（也可以用SD/-Leu/-Trp液体培养基培养至OD600=0.2）。
2. 再用0.9% NaCl依次稀释10倍，100倍，1000倍（即OD600=0.2，0.02，0.002，0.0002）。
3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板10 μL于SD/-Leu/-Trp，SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT*平板（如果已知自激活浓度，需加入对应的3-AT浓度），参考图1。
4. 30 ℃培养2-3 d，观察每组重组酵母在对应的自激活3-AT浓度平板上生长状况，从而确定是否互作。
四
互作验证分析
4.1 互作
由图1可知，在SD/-Leu/-Trp平板上，对照组Y187[p53-His2+pGADT7-p53]和Y187[p53-His2+pGADT7]长势相同。在SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(25 mM)平板上，Y187[p53-His2+pGADT7-p53]长势明显优于Y187[p53-His2+pGADT7]，所以p53-His2与pGADT7-p53具有互作。同理，Bait1和Prey1也有互作。
4.2 Prey蛋白有毒性
由图1可知，在SD/-Leu/-Trp平板上，Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2]长势弱于对照组Y187[pBait2-His2+pGADT7]，可能是Prey蛋白有毒性导致；但是在SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(25 mM)和SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT(50 mM)平板上，Y187[pBait2-His2+pGADT7-Prey2]长势优于Y187[pBait2-His2+pGADT7]，所以Bait2与prey2有互作。
注：酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的Prey蛋白。
4.3 无互作
由图1可知，在所有的SD平板上，Y187[pBait3-His2+pGADT7-Prey3]/Y187[pBait3-His2+pGADT7]和Y187[pBait4-His2+pGADT7-Prey4]/Y187[pBait4-His2+pGADT7]长势都相同，所以Bait3与prey3，Bait4与prey4均无互作。
4.4 Bait有自激活
Y187[pBait5-His2+pGADT7-Prey5]和Y187[pBait5-His2+pGADT7]在所有的3-AT(50mM)平板上长势均相同，所以Prey5具有自激活。
自激活更多问题解答可参考官网：酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇
注：Y187[pBait3-His2+pGADT7]仅在SD/-Leu/-Trp平板上生长，说明Bait3无自激活。Y187[pBait5-His2+pGADT7]能够在SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT (50 mM)平板上长势相同，说明Bait5具有一定的自激活。
图1 点板互作验证结果示意图
总结
本方案中检测诱饵酵母菌株的3-AT最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法，与涂板的方法相比，点板法能更直观的体现出DNA与蛋白的互作，还能减少培养基和3-AT的使用量。而且Bait和Prey共转化Y187，可以大大减少实验时间。如果各位朋友需要使用Y187-pHis2系统，那么本方案是一个较好的选择。在酵母单杂实验中，如果Bait有较强的自激活现象，我们更推荐Y1HGold-pAbAi系统，Y1HGold报告基因为AbAr，不仅可以很好的抑制诱饵自激活，而且能大大降低酵母单杂假阳性的概率。
更多问题解答，可联系Coolaber公司：
电话：400-878-6800
邮箱：Coolaber@126.com
END
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