NK细胞疗法是一种新型的免疫治疗手段，显示出治疗肝细胞癌的潜力。NK细胞具有无需抗原敏化即可杀死肿瘤细胞的能力。通过颗粒依赖和非颗粒依赖途径，NK细胞可以有效地杀死靶细胞。临床试验表明，来源于外周血、诱导多能干细胞和脐带血的异体原代NK细胞在治疗恶性肿瘤时相对安全，不会引起严重的毒性反应。
TGF-β通路
转化生长因子-β（TGF-β）在HCC中通常过表达，具有促进肿瘤发展的作用。TGF-β通过抑制NK细胞和T细胞的功能来增强免疫抑制效应，不仅直接抑制NK细胞的活化和细胞毒性，还通过促进免疫抑制细胞的活性，进一步抑制免疫系统的抗肿瘤反应。
为了验证TGF-β在HCC治疗中的作用，加州大学的团队进行了一项研究，试图通过工程化NK细胞以克服TGF-β的抑制，并引入针对肝细胞癌的CAR，以达到显著增强NK细胞的抗肿瘤活性的目的。
抑制TGFBR2表达无负面影响
研究发现，删除或抑制TGFBR2基因并不会影响NK细胞的多能性、分化和特性。研究中使用CRISPR-Cas9技术删除了TGFBR2基因，并利用Piggybac系统引入了抑制TGF-β信号的基因。这些基因改造的多功能干细胞能够正常生长，并生成均一的NK细胞群体。分化过程中，TGFBR2基因删除和抑制的肝细胞能够有效生成血液祖细胞，并进一步分化为NK细胞。
TGF-β激活下改造NK细胞仍有强大的抗肿瘤活性
与野生型多功能肝细胞分化的NK细胞相比，这些改造的NK细胞在对抗肝细胞癌时表现出更好的抗肿瘤效果。即使在高浓度TGF-β环境中，TGFBR2缺失或抑制的NK细胞也能有效杀死肿瘤细胞，而野生型NK细胞在相同条件下表现较差。
此外，TGFBR2缺失或抑制的NK细胞在功能上也更为活跃，表现出更高水平的NK细胞活化指标（如CD107a、IFN-γ和TNF-α）。这些研究表明，TGFBR2基因的改造使NK细胞能够在TGF-β丰富的环境中依然发挥强大的抗肿瘤作用。
与CAR结合再次增强抗肿瘤活性
之后研究者在改造的NK细胞中加入抗肝细胞癌的CAR，并评估CAR是否能增强它们的抗肿瘤活性。首先在这些多功能干细胞中引入了抗GPC3或抗AFP的CAR，这些修饰后的细胞成功分化为了能正常的NK细胞。
测试结果显示，所有NK细胞都能有效杀死K562细胞，而改造后的NK细胞在表达抗GPC3或抗AFP的CAR后，对HepG2和SNU-449肝癌细胞的杀伤力显著增强。即使在高浓度TGF-β存在的情况下，这些修饰后的细胞仍然保持强大的抗肿瘤活性，而未修饰的野生分化来源的NK细胞在同样条件下活性受到抑制。
抗肿瘤基因的高表达
研究者研究了TGFBR2基因敲除和负调控改造的NK细胞，并发现它们在标准培养条件下，表现出更高的抗肿瘤活性。通过RNA测序，这些细胞中有许多与抗肿瘤、肿瘤浸润、细胞增殖和NK细胞活化相关的基因表达显著不同。这些基因包括CD226、GZMH、GZMB、IFNG、IL-18和CXCR4等。在记忆样培养条件下，TGFBR2基因敲除和负调控的NK细胞的这些基因表达更为明显，说明它们的抗肿瘤活性更强。
动物实验结果
研究团队使用野生来源NK细胞和改造NK细胞（无论是否有CAR），对HepG2肿瘤小鼠模型的抗肿瘤效果。结果显示，所有接受NK细胞治疗的小鼠在7天后肿瘤体积明显减少。
但随着治疗时间的延长，表达CAR的改造NK细胞的抗肿瘤效果优于表达相同CAR的野生NK细胞。
此外，即使没有抗肝细胞癌 CAR的改造 NK细胞也表现出强大的抗肿瘤活性，并显著提高了小鼠的存活率。
这些结果表明，抑制TGF-β活性对于增强NK细胞的抗肿瘤能力非常重要，这与体外研究中的发现一致，即TGF-β的激活减少了野生NK细胞的抗肿瘤活性，但对敲除TGFBR2的改造NK细胞没有影响。
总结
结果表明，破坏TGF-β信号有助于保持NK细胞在TGF-β丰富的肿瘤微环境中的持久性和有效的抗肿瘤活性。随着NK细胞疗法进入肝癌这类难治的恶性肿瘤的临床试验，破坏TGF-β信号是提高NK细胞（无论是否表达CAR）抗肿瘤活性的关键。
参考文献
Thangaraj et al., 2024, Cell Stem Cell 31, 1–17 September 5, 2024 ª 2024 Elsevier Inc. All rights are reserved, including those for text and data mining, AI training, and similar technologies. https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.06.009
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