关于临床开展多重呼吸道病原体核酸检测的必要性和重要性，之前《多重呼吸道病原核酸检测质量如何？室间质评结果显示……》一文已做过具体介绍，此处不再赘述。为了满足临床需求，近两年越来越多的临床实验室都开展了此项目。而随着有证试剂和实验室自建项目（LDT）的增加，临床所用的多重呼吸道病原体核酸检测试剂也越来越多。因其具有方法学众多、检测靶标各异、操作流程不同等特点，加之各实验室检测人员间能力不一，以上因素均会对检测质量造成不利影响，从而导致实验室检测结果出现问题。
为了评估临床实验室的检测能力，上海临检中心于2022年起开展此项目的室间质评（EQA）活动。先前数据表明临床实验室整体检测能力尚可，但也存在一些问题。为了更全面真实地评价该项目的检测能力，我们在今年九月初又组织开展了一次全国范围的EQA调查活动，并于九月底发布了相关成绩。国庆节后即有不少同行联系我们，就EQA中的具体问题沟通交流，也有不少人建议能再介绍下相关情况，下面我就再简单汇总下此次多重呼吸道病原体核酸检测EQA整体的检测情况。考虑常见具有代表性的呼吸道病原体类别，共计选择11种病毒（流感病毒/呼吸道合胞病毒/腺病毒/副流感病毒/偏肺病毒/鼻病毒/冠状病毒）和1种支原体（肺炎支原体），制备上述病原体的单一感染和合并感染（2重和3重）模拟样本。上述灭活病原体经病毒保存液稀释后分装为15个样本，具体组成如下：![]()
除对常见呼吸道病原体检出能力进行考核外，还需重点提及的是：此外，与先前研究一致，考虑到高浓度样本对评价实验室检出能力作用不大，故EQA中未设置高浓度样本，所有EQA样本Ct值在32-37间，也即为中低浓度样本。所有EQA样本均经多种有证试剂验证，结果证实其均含有预期病原体。
还需说明的是，为避免样本运送过程中发生降解，我们模拟了样本包装、运送、检测相关环节，进行了同步稳定性检测，结果证实除10号样本人偏肺病毒外（评价部分会细说评价方式），其余EQA样本的稳定性良好。为客观真实反应实验室检测能力，我们对样本进行了乱序处理。初始报名：共计来自27个省份的305家实验室报名。![]()
最终回报：共计收到27个省份的269家实验室回报结果，但有10家实验室仅回报了Ct值，未填报定性结果，因而不予评价。最终，我们评价了来自27个省份的259家实验室的检测结果。
![]()
参评实验室所用试剂情况如下图所示。由图中可见，239家实验室使用了有证试剂，在所有试剂中占比约为92.3%（239/259），这也说明合规是绝大多数实验室考虑的主要因素。此外，有2家实验室使用了多个有证单检试剂（达安基因）或小panel联检（安图生物）方式进行检测。
![]()
此外，还有20家实验室回报了实验室自建方法检测结果。结果显示约近半实验室使用的是实时荧光PCR法，但检测的病原体数量相对有证产品会更多。除此之外，还有2家实验室分别使用了荧光PCR熔解曲线法和CRIPSR法。需要提及一点的是，仍有部分实验室使用了tNGS或mNGS进行了EQA样本检测，我们并不建议使用上述方法，这点在先前EQA报名通知和项目说明书中都已做过明确说明。
![]()
随后，参照如下评分标准对结果进行评价汇总：实验室应按所用试剂检测病原体范围进行结果判定，与样本预期结果完全一致为符合，否则不符合。实验室整体合格标准为≥80%样本符合，即0-3个样本不符合为成绩“合格”；＞3个样本不符合为成绩“不合格”。为了更好地给大家呈现出整体情况，下面将按照“优秀”（全部样本符合）、“合格”（1-3个样本不符合）、“不合格”（＞3个样本不符合）的标准分类展示最终成绩，其整体分布情况如下图所示，可见本次EQA的整体合格率为73%，但优秀率仅为44%（不如上一轮）。
![]()
样本检测符合率
15个EQA样本检测的整体符合率情况如下图所示。首先说明下，因10号hMPV样本同步稳定性数据显示其出现核酸降解情况，虽最终也有14家实验室回报了hMPV阳性结果，从严谨性角度考虑我们未对hMPV检出情况进行评价。但此样本仍以阴性样本为靶值进行评价，如实验室回报假阳性结果，此样本仍判定为不合格。![]()
由图中可见，所有样本均出现样本检测不合格情况。但与之前随样本浓度降低检出率逐步下降不同，某些样本浓度并非很低，但不合格率反而增加，如1号和2号甲流样本对比，分析其主要原因为部分试剂对特定病原体的检出率较差。除甲流样本外，ADV3和ADV5样本的符合率差别也可直观地说明这点。但令人欣慰的是，上轮次出现的个别试剂对RSV整体检出率较低的问题未再出现。冠状病毒229E的检出情况也表明相关试剂对该病毒的检出能力整体不错。对259家实验室数据进行分析，发现共计34家实验室回报了101个假阳性结果，进一步分析回报数据后，我们排除掉6家实验室数据（1家实验室反馈填报错误，所有样本均回报MP(+)结果；5家为非自己实验室检测结果，后面会细说），最终有29家实验室回报了44个假阳性结果，可见上述6家实验室导致了大多数的假阳性结果，剔除掉这6家后，总体假阳性结果很少。其中大部分假阳性结果为本次EQA已包含样本，这说明其可能为人为操作误差所致。此外，还有少部分假阳性结果为本次EQA活动不包含样本，如新冠病毒、博卡病毒等，这很可能为实验室气溶胶污染或人为判读错误等所致。相比假阳性情况，假阴性情况就更为普遍，共计144家实验室回报了606个假阴性结果（之前提到的6家实验室回报了46个假阴性数据，未导致假阴性结果大幅度增加），这很可能和本次EQA样本浓度不高有关。14家实验室出现了超过10个及以上的假阴性结果，其中部分为同一试剂品牌，剩余为LDT方法，这提示其实验室检测系统可能存在较大问题，如核酸提取效率、检测试剂灵敏度、人员操作能力等。检测能力方面：从整体检测情况来看，特别是结合假阳性和假阴性情况，可以看出部分实验室检测系统存在较为明显问题，各实验室可重点分析相关原因，如核酸提取试剂效率（手工法、非配套提取系统、试剂批间差等）、核酸检测试剂（检测性能、批间差等）、人员检测能力等因素。再说明一下，因检测系统涉及因素较多，检测结果问题并非单单由检测试剂所致，所以实验室可以让厂商来协助分析试剂性能，而非让厂商来明确具体原因；
自身态度方面：出于某些原因，部分实验室间会比对结果，即便彼此间结果不一致，我认为大部分实验室仍会回报自己所做结果。但有个别实验室却直接回报了其他实验室检测结果，从而导致全部样本检测不符合，这不管是对于自身，还是所在机构，都是极不负责的态度。
先前EQA数据显示部分试剂对于RSV和ADV检测能力欠佳，我们也对EQA样本做了针对性设计。此次结果显示RSV检出情况未再出现之前情况，这也表明我们之前和厂家的沟通起到了不错的效果。但是，此次EQA数据仍显示核酸检测试剂方面还存在一些问题，比如：同一试剂对不同ADV亚型检出存在差异：ADV3和ADV5的检出情况也清晰表明了这点，之前我们仅发现一家试剂存在类似问题，但这次发现不止一家，这也提示对于亚型众多的病原体靶标，如何设计特异性引物探针这块确实不易；
不同试剂对不同流感亚型检出存在差异：因在预实验时已发现此情况，即不同试剂对同一甲流样本的检测Ct值存在较大差异，我们也做了针对性EQA样本设置。回报结果也进一步证实了此问题，说明部分试剂对低浓度甲流病毒的检出能力较差；
个别试剂对多数病原体检出能力存在问题：多家实验室回报数据显示个别试剂对多个低浓度样本的检出能力存在问题，可能意味着检测试剂自身检测灵敏度不高，当然也不排除核酸提取试剂存在问题。
小 结
从多重呼吸道病原体EQA调查结果可以看出，开展该项目的不少实验室整体检测能力欠佳，仍需进一步整改提升。部分核酸检测试剂质量方面亦存在一些问题，这会显著影响检测结果的准确性。若非可提供多个实验室结果的EQA数据，其实在单一实验室很难发现此类问题，建议试剂厂商也应对其性能再评估后进行优化改进提升。临床实验室也应选择性能优良试剂，认真做好性能验证工作后规范开展相应项目。此外，做好全流程的质量保证，特别是加强人员能力建设是各实验室做好质量保证极为重要的一个前提。基于此，我们才能更为有效地保证该项目检测结果的准确可靠，才能为临床诊疗和疫情防控等提供有力支撑。注：文中所有观点仅代表作者个人意见，不代表所在机构意见。
![]()
