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卵巢对女性的生殖和健康至关重要，因为它能产生卵母细胞并分泌性激素。间充质干细胞 (MSCs) 的移植已被证明可以缓解病理性卵巢衰老。然而，尚不清楚 MSCs 是否有益于自然衰老的卵巢。
最近，中国医学科学院北京协和医学院妇产科、干细胞与生殖生物学国家重点实验室、郑州大学第一附属医院生殖医学中心等成员组成的研究小组，在自然子刊《细胞发现》上发表题为：“干细胞移植延长自然衰老食蟹猴的生殖寿命”的研究成果中，研究了中国女性在围绝经期卵巢储备的动态。使用自然衰老的食蟹猴 ( Macaca fascicularis ) 模型，发现将人类胚胎干细胞衍生的 MSC 样细胞（以下称为 M 细胞）移植到衰老的卵巢中，可显著减少卵巢纤维化和 DNA 损伤，增强性激素分泌并提高生育能力。
论文发表在自然子刊《细胞发现》上
令人鼓舞的是，M 细胞移植后，一只健康的小猴出生了。此外，单细胞 RNA 测序分析和体外功能验证表明，M细胞移植后，颗粒细胞和基质细胞中的细胞凋亡、氧化损伤、炎症和纤维化得到缓解。让我们一起来看看是怎么回事。
卵巢，反映女性衰老的一把尺
卵巢是重要的女性生殖器官，是卵母细胞和性激素的来源。卵巢功能高度依赖于卵巢储备，卵巢储备指的是卵巢皮质内原始卵泡的数量。卵泡是卵巢的功能单位，由卵母细胞组成，周围是颗粒细胞 (GC) 和卵泡膜细胞 (TC) 。女性出生时就拥有有限的原始卵泡，这构成了她们最初的卵巢储备。当进入青春期后，大量原始卵泡定期被募集并发育成生长卵泡，因此，卵巢储备会随着年龄的增长而逐渐减少，最终导致更年期。
卵巢储备，特别是在围绝经期，非常重要，在欧洲和北美人群中已得到广泛的研究。据报道，围绝经期卵巢中仍然保留有少量原始卵泡。这非常令人兴奋，因为使这些原始卵泡发挥功能可能会延长女性的生殖寿命并推迟更年期的开始。
不同人口统计数据中的更年期开始年龄各不相同，说明不同种族的女性可能具有不同的卵巢储备大小和卵巢储备下降速度。然而，尚未有关于亚洲女性卵巢储备研究的报道。中国女性在约 37 岁时生育能力明显下降，46 岁进入围绝经期，通常在约48.6岁达到更年期。
更年期的特征是雌二醇 (E2) 和孕酮 (P4) 分泌减少、闭经以及卵巢和子宫内膜萎缩。更年期妇女可能患有骨质疏松症、心血管疾病和神经退行性疾病。更重要的是，过去几十年来，女性的平均预期寿命不断提高，而更年期年龄几乎没有变化，这表明女性现在有超过三分之一的人生时间处于更年期后。因此，减缓卵巢衰老对女性的长期健康至关重要。
实验流程图解
激素替代疗法 (HRT) 通常被建议用于缓解因雌激素缺乏导致的更年期症状。然而，关于 HRT 的最佳类型、方案和剂量的证据很少。此外，HRT 会增加患冠心病、浸润性乳腺癌和中风等慢性疾病的风险。在准确了解卵巢衰老本质的基础上，制定更安全、更有效的缓解自然卵巢衰老的策略至关重要。
卵巢衰老的特征是高水平的氧化应激 (OS)、DNA 损伤、炎症和纤维化。已有研究证明卵巢衰老与活性氧 (ROS)高度相关。线粒体呼吸链产生的过量ROS导致氧化还原反应失衡并诱导体内OS状态，而OS已被证明是女性年龄相关性不孕症发病机制中的关键。大量的ROS 通过修饰核苷酸、断裂DNA链和引入突变来造成DNA损伤。DNA损伤可导致染色体异常，从而可能导致不孕和卵巢衰老。此外，ROS 积累通过激活核转录因子-κB 引发促炎作用。
据其他研究报道，卵巢炎症通路的激活可能会破坏卵泡发育并降低卵母细胞质量。炎症是纤维化的重要诱因，导致排卵障碍和卵巢伤口愈合。开发新的治疗方法至关重要，通过减少氧化损伤、细胞衰老、炎症和纤维化从根本上激活卵巢，从而促进卵泡发育并恢复卵巢功能。
基于间充质干细胞 (MSC) 的疗法已成功恢复动物模型或卵巢功能不全女性的生育能力，表明该策略在改善生理性卵巢衰老方面具有潜力。据报道，通过股静脉将来自幼年恒河猴的 MSCs 注射到老年恒河猴体内可逆转老年个体的卵巢衰老。然而，MSC 治疗背后的治疗机制尚未清楚地阐明。此外，从年轻个体获取 MSCs 的方法限制了其在临床环境中的潜在应用。最近，一种新型干细胞，即人类胚胎干细胞 (hESC) 衍生的 MSC 样细胞（缩写为 M 细胞），类似于 MSC，因其具有更强的免疫调节和抗纤维化功能并且可以大规模生产而备受关注。
解读中国围绝经期女性的卵巢储备
为了解中国围绝经期女性的卵巢储备功能，研究团队收集了26名年龄在35–52岁的中国女性的28个卵巢，并按照五年的间隔将其分为四组：35–39 岁、40–44 岁、45–49 岁和 50–52 岁。研究团队使用之前开发的方法进行卵泡计数和卵巢储备估计。通过 H&E 鉴别卵巢切片中的不同阶段卵泡，计数了原始卵泡。
每个卵巢的平均原始卵泡数量从35-39岁期间的11,098个减少到40-44岁期间的6728个。到45-49岁时，原始卵泡数量急剧减少到1019个。在50-52岁期间，卵巢中残留151个原始卵泡。
此外，为了阐明原始卵泡内卵母细胞的大小是否随年龄增长而变化（从而影响卵母细胞的质量），研究团队计算了原始卵泡的卵母细胞和卵母细胞核的平均直径。发现年轻卵巢和衰老卵巢的原始卵泡卵母细胞和卵母细胞核的直径相当，这表明原始卵泡的大小不会随着年龄的增长而变化。为了确定围绝经期卵巢是否仍会发生卵泡发生，随即检查了初级卵泡的数量。
初级卵泡的数量随年龄增长而减少：35-39 岁平均978个，40-44岁平均736个，45-49岁平均161个，50-52岁平均39个。初级卵泡与原始卵泡的比例随年龄增长而增加，表明原始卵泡数量迅速减少，此外，49岁卵巢中部分初级卵泡可进一步发育为次级卵泡，提示围绝经期妇女卵巢中的原始卵泡仍可发育为生长卵泡。
围绝经期妇女卵巢中的原始卵泡仍可发育为生长卵泡
为了检验卵巢储备的动态变化是否伴随人类卵巢的微环境变化，研究团队测量了围绝经期卵巢的纤维化水平。采用Masson三色染色评估卵巢纤维化。发现从37岁到50岁，纤维化显著增加，并且这些阶段的卵巢纤维化水平明显高于23岁。综上所述，揭示了围绝经期中国女性卵巢中存在原始卵泡，并且卵巢储备的下降伴随着卵巢纤维化的延长。
恢复自然衰老的卵巢功能
延长生殖寿命
人类和猴子卵巢衰老的相似性使猴子成为研究M细胞移植在改善人类生理性卵巢衰老方面的安全性和有效性的良好模型。更年期过渡期的标志是月经周期长度的变化增加和生殖内分泌异常。研究团队根据年龄、月经周期、超声下的卵巢和子宫形态以及性激素水平选择了围绝经期食蟹猴。
由于猕猴属的物种在~25岁进入绝经期，我们选择了10只年龄在18-23岁的食蟹猴。所有猴子均表现出月经不调，表明它们进入了围绝经期。超声观察发现，这些恒河猴的卵巢平均直径为5.56±0.16 mm，子宫内膜平均厚度为4.88±0.41 mm。月经周期早期卵泡期雌二醇平均为56.63±6.2 pg/mL，低于以往研究报道的幼年恒河猴雌二醇水平。这些结果表明所选恒河猴正处于围绝经期，适合开展M细胞疗法减缓卵巢自然衰老的研究。
研究团队将猴子随机分为治疗组 (n=7) 和对照组 (n =3)，在猴子的双侧卵巢中注射了两次 M细胞，间隔一个月。治疗组（T01–T07）每侧卵巢注射100 μL 0.9%生理盐水中5 × 10 6 M 细胞，而对照组（C01–C03）则注射100 μL 0.9%生理盐水，在8个月的随访中评估M细胞移植的安全性和有效性。在此期间，测量了体重、追踪月经、通过超声扫描检查卵巢和子宫形态，并检测了猴子的性激素水平。截至最后一次随访，食蟹猴均健康，无一例出现急性炎症或恶性疾病，这表明M细胞移植是安全的。
在治疗1、2、3、4、5和6个月后对对照组和治疗组猴子进行了超声扫描。治疗组的卵巢直径明显大于对照组。治疗组猴子的子宫内膜明显比对照组（3.71±0.54 mm）厚（5.07±0.33mm）。这些结果表明M细胞移植可能有利于卵泡发育并增加子宫内膜厚度。并且结果还表明，M细胞移植可以有效促进自然衰老的食蟹猴性激素分泌。
M细胞移植可能有利于
卵泡发育并增加子宫内膜厚度
接下来，为了验证猴子在M细胞移植后是否能够自然受孕，研究团队在治疗两个月后将对照组和治疗组的所有猴子转移到繁殖笼中，并将它们与有生育能力的成年雄性配对两个月以进行自然交配。然后将所有猴子放回单笼中，并继续进行定期随访监测。
妊娠5周的胎囊和妊娠9周的胎儿
令人鼓舞的是，治疗组中的一只老龄猴子怀孕了，而对照组猴子均未怀孕。通过超声扫描观察到妊娠5周的胎囊和妊娠9周的胎儿，表明胎儿发育正常。此外，研究团队还测量了怀孕猴的性激素水平，发现血清中E2水平从怀孕前的51.33 pg/mL上升到怀孕3个月后的 779.4 pg/mL，P4水平从怀孕前的0.94 ng/mL上升到怀孕3个月后的6.13 ng/mL。怀孕猴最终产下了一个健康的足月猴宝宝，宝宝现已长到3岁，健康成长。这只猴宝宝（P1）的营养状况和发育状况与年轻母亲所生的后代（同龄的5只雄性和3只雌性）相当。初步表明了M 细胞移植可能提高自然衰老食蟹猴的生育潜力。
为了进一步验证M细胞是否能够促进卵泡发育，研究团队在治疗4、16和25个月后用H&E对对照组和治疗组的卵巢切片进行染色，并计算了正在生长的卵泡数量，包括初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡。
M细胞减轻了衰老卵巢的炎症
结果显示，治疗组的正在生长的卵泡数量多于对照组。这些结果表明M细胞移植提高了自然衰老猴子的生育潜力。为了研究M细胞移植是否可以缓解卵巢衰老，他们检查了对照组和M细胞治疗组猴子卵巢的衰老特性。结果显示，治疗组卵巢的纤维化明显低于对照组，这表明 M 细胞减轻了卵巢 DNA 损伤。进一步证明M细胞移植提高了生育能力，促进了卵泡发育和细胞增殖，并抑制了纤维化和 DNA 损伤。
研究团队还通过scRNA-seq 分析揭示了M 细胞移植恢复卵巢功能的潜在分子机制。他们根据单个细胞的转录组谱和特征基因确定了10个主要细胞群，包含除卵母细胞外的所有预期细胞类型。结果显示，内皮细胞和周细胞比例在M细胞移植后明显增加，提示治疗组中血管生成更为活跃，表明M细胞移植后卵泡发育得到恢复。值得注意的是，M细胞移植后基质细胞（SC）逐渐减少，提示卵巢衰老特征得到缓解。此外，治疗组卵巢中巨噬细胞比例在治疗4个月和16个月后减少，提示M细胞减轻了衰老卵巢的炎症。
结论与展望
卵巢生理性衰老是影响女性生育能力并降低生活质量的必然过程，目前尚无有效的治疗方法可以根本性地恢复卵巢功能并提高生育能力。本研究中，研究团队利用围绝经期食蟹猴作为非人灵长类动物模型来评估，M干细胞移植在缓解卵巢自然衰老方面的安全性和有效性。研究结果证实了细胞疗法可减少炎症、纤维化、氧化损伤和细胞凋亡，并增加围绝经期卵巢的性激素分泌。为细胞治疗可促进卵巢功能恢复的提供了有力的证据。
M细胞可能通过减少炎症和纤维化，以及促进血管生成、卵泡发育和性激素分泌来部分改善卵巢衰老
最后，研究团队还提示，从成人或围产期组织中分离出的 MSC 数量有限，且细胞是异质性的。此外，这些MSC在体外传代过程中容易衰老，这进一步限制了它们在干细胞治疗中的潜力。而本研究中使用的M细胞来源于hESC（人胚胎干细胞），与MSC相似，因为它们满足MSC的所有标准。此外，M细胞可以在体外充分扩增，而不受限制或经历衰老。
综上所述，这项研究揭示了中国女性围绝经期卵巢储备功能，并通过人胚胎干细胞来源的MSC(M细胞)移植,恢复了自然衰老灵长类动物的卵巢功能。M细胞可减轻自然衰老卵巢中的炎症、纤维化、氧化损伤和细胞凋亡，并促进血管生成和卵泡发育。研究结果为M细胞在改善女性生殖衰老和提高生育能力方面的临床应用提供了希望。
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