Y1Hgold系统酵母单杂筛库

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm或Φ150 mm培养皿，备用。

2. Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3. 稀释金担子素：取100 μL AbA（1 mg/mL）于900 μL无水乙醇中稀释，充分混匀，即AbA浓度为100 μg/mL，4 ℃冰箱中备用（稀释10倍后使用，有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释）。

4. 自备0.9%生理盐水，可用ddH2O无菌水代替，备用。

5. 普通平板制备

将1条培养基溶于0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4 ℃冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm）或70-75 mL/块倒平板（Φ150 mm），凝固后4 ℃冰箱保存。

6. 特殊平板制备

SD/-Leu（AbA）或SD/-Ura（AbA）：将一条SD/-Leu with Agar培养基溶于500 mL去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，参照表1加入稀释后的金担子素（AbA），倒平板（20 mL/块，Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。

二、 菌株使用与保存

1. 挑取一环甘油保存的菌液（10-50 μL）于SD平板上划线，28-30 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2. 挑取上述单菌落于SD液体培养基中，200 r/min、28-30 ℃振荡培养2 d，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。

注：Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]和Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]用SD/-Leu培养基，Y1HGold[p53-AbAi]用SD/-Ura培养基。

3.1.1 pBait-AbAi质粒线性化

pBait-AbAi、p53-AbAi和Mutant Bait pAbAi（选做）测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。用Bstb I限制性内切酶（NEB）进行线性化处理。

诱饵载体酶切体系

65℃酶切2 h，0.8%的琼脂糖跑胶，检测载体是否酶切完全，纯化回收。

3.1.2 pBait-AbAi转化Y1HGold

1 取100 µL冰上融化的Y1HGold感受态细胞（货号：CC308），依次加入预冷的线性化质粒5 μL（2-5 µg），Carrier DNA 10 µL（95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30s弃上清。

4 ddH2O 50 µL重悬，涂板SD-/Ura平板，30℃培养3-5 d。

注：同时将Y1HGold阳阴性菌株于SD平板划线活化。

3.1.3 诱饵菌株鉴定

1. 准备PCR预混液：根据检测克隆数，等比例扩大配制体积。

2. 吸取5 μL酵母快速裂解液加入PCR管中。

3. 用无菌牙签或10 μL枪头刮取筛选出来SD/-Ura固体培养基上的单菌落（直径1-2 mm，刮取1/4即可）悬浮在裂解液中。

4. 吹打或者震荡混匀后使用PCR仪98℃裂解5 min，即为裂解产物。

5. 在裂解产物中加入45 μL PCR预混液（含引物），PCR扩增。PCR反应条件：98℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min（15-30 s/kb）；72℃ 5 min。35个循环。

6 将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳并测序验证。

注：

a. 本公司提供的酵母基因组菌落PCR试剂盒中Y1H引物混合物（未公开序列）扩增空载pAbAi重组Y1HgGold的产物为1346 bp。测序可以用pAbAiF（GCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTC），或插入片段的特异性引物。

b. 用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，鉴定阳性克隆，消除假阳性(PCR分析结果应为：阳性对照. 1.4 kb；阴性对照. 无条带；诱饵菌株. 1.35 kb+insert size)。

1. 上述转化验证成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3mm）于1 mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD₆₀₀调至0.002（也可以用SD-Ura液体培养基培养至OD₆₀₀=0.002）

2. 取100 μL菌液分别涂布到含不同AbA浓度的SD/-Ura平板上，30℃培养2-3 d；

3. 观察诱饵酵母在不同AbA浓度平板上生长状况，从而确定AbA最佳使用浓度。

注：在不同浓度AbA平板上（0，100 ng/mL，200 ng/mL，300 ng/mL，500 ng/mL，700 ng/mL，1000 ng/mL），出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为AbA最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下筛库自激活AbA浓度不宜超过800 ng/mL。

1. 挑取鉴定成功的Y1HGold[pBait-AbAi]单菌落接种到含有3 mL YPDA液体培养基的15 mL摇菌管中。30℃，200 rpm过夜培养。

2. 将3 mL小摇菌体(上步小摇所得)接到含有50 mL液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000 rpm离心5 min，弃上清。（4 ℃保存1周内的酵母菌液，用3 mL接种50 mL YPDA培养基过夜培养亦可）。

3. 用10 mL Y1溶液重悬沉淀，3000 rpm离心5 min，弃上清。

4. 加入600-1000 μL Y2溶液重悬，转文库按600 μL分装，转质粒按100 μL分装，可直接用于转化或冷冻保存。

注：制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。

5. 取上述Y1HGold[pBait-AbAi]感受态细胞600 µL于冰上，依次加入预冷的15 μg cDNA文库质粒（约30μL）、2520μL Y3溶液，轻柔吸打混匀，30 ℃水浴90 min (10 min时翻转1次混匀)。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过3小时。

注：文库质粒加入量与文库质量有关，可根据实际情况加入。建议用ddH2O补充体积，将质粒与Y3溶液的体积定容为2.6 mL。

6. （可选步骤）3000 rpm离心5 min，弃上清。用3 mL YPD Plus Liquid Medium重悬沉淀，30 ℃摇床震荡培养90 min。

7. 3000 rpm离心5 min，弃上清。加入15 mL 0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板。

注：上述为酵母大规模转化，将文库质粒转化进诱饵酵母菌株中；同时做小规模转化将pGADT7和pGADT7-53转化Y1HGold[p53-AbAi]作为阴、阳对照，涂布在SD/-Leu。本试剂盒已包含阳性对照菌，在相应的培养基上划线培养即可。

8. 取上一步的50 µL重悬菌体，按1/10、1/100、1/1000比例稀释，各取100 μL菌液于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA*两种平板（Φ90 mm）涂布；

9. 剩余重悬菌体，每150 μL涂布于SD/-Leu/AbA*平板（Φ150 mm）；

注：总共15mL，每板150 μL可涂布100块。每板可以适当增加重悬菌体量，减少平板数量，建议35-100块平板（Φ150 mm）。与自激活浓度相比，筛库平板AbA*浓度应高出50 ng/mL。

10. 30 ℃培养3-5 d，统计SD/-Leu (Φ90 mm)平板上单菌落数目，计算文库筛选克隆数。

文库筛选克隆数= [cfu/mL on SD/-Leu]×[稀释倍数]×[重悬体积 (15 mL)]

转化效率=克隆细胞数×悬浮体积（mL）×稀释倍数×[涂板子体积（mL）×总DNA的量（μg）]-1

注：SD/-Leu平板上，至少要有1.0×106个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。SD/-Leu/AbA*平板上，非常少克隆数往往与诱饵序列和文库质量有关。有研究表明30万个克隆也能筛选到阳性克隆。

4.1 筛选阳性克隆

1. 复筛活化菌株

（可选步骤）将筛选得到的单菌落于SD/-Leu/AbA*平板划线，2-4 d能够生长的菌落再用于后续验证。

注：此步骤选做，与下面的复筛鉴定互作酵母菌株有重复。

2. 菌落PCR鉴定互作酵母菌株

选择直径约为2~3 mm的克隆，菌落PCR扩增，引物为pGADT7-F/R，PCR体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒（货号：SK2420）。

3. 复筛鉴定互作酵母菌株

电泳条带大于400 bp（根据实验目的和实际情况而定）的单菌落，划线于SD/-Leu/AbA*培养基上，30℃培养2-4 d。有多条电泳条带的单菌落（含有多个质粒的转化子），需要在SD/-Leu/AbA*筛选培养基上重复划线培养2-3代，然后通过菌落PCR的方法选出具有单个质粒的克隆。

4.2 互作克隆鉴定

互作克隆鉴定也称点对点互作验证或回转验证。在回转验证实验中，AD载体有两种形式，文库质粒或完整的CDS转录因子重新构建pGADT7质粒，都可以用于验证实验。可以参考本公司的Y1HGold单杂互作验证试剂盒，这里仅做简要描述。

将上述PCR产物送公司测序，使用BLAST序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，根据测序和序列比对结果，与数据库中转录因子同源性高的文库质粒，进行文库质粒提取，重新转化Y1HGold[pBait-AbAi]菌株。或通过NCBI在线Blast分析转录因子CDS，然后根据其对应的引物，以cDNA为模板（建库时的cDNA），扩增转录因子全长，重新构建pGADT7载体，并转化Y1HGold[pBait-AbAi]菌株。

4.2.1文库质粒回转验证

1. 用SD/-Leu液体培养基摇阳性酵母克隆菌株，离心收集菌体并提取文库质粒。如果阳性克隆超过60个，方法参见96孔一步法酵母质粒小提试剂盒（货号：PE056，见报于Nature 等期刊）；如果阳性克隆少于60个，方法参见一步法酵母质粒小提试剂盒（货号：PE055）。

2. 从酵母中提取的文库质粒转入E.coli感受态细胞，转化液全部涂布在含Amp的LB培养基上，37℃培养16 h。每个样品取3-5个克隆（重复）进行菌液PCR鉴定。

3. 挑取鉴定成功的单菌落摇菌，提取大肠杆菌中的文库质粒，方法参见质粒小提试剂盒说明书。

4. 提取的文库质粒转入Y1HGold[pBait-AbAi]为实验组。pGADT7空载体转入Y1HGold[pBait-AbAi]对照组，可以更好的体现实验组是否互作。文库质粒转入Y1HGold[Mutant Bait pAbAi]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略，如表2 表3。

5. 文库质粒转化诱饵菌株，快速离心转化液，0.9%的氯化钠溶液分别悬浮转化菌体，涂布SD/-Leu培养基上，30℃培养3-5 d。

6. 取转化后的重组子菌落，重悬于0.9%的氯化钠溶液中，将OD600调至0.2、0.02、0.002、0.0002。分别取100 μL菌悬液涂布于SD/-Leu/AbA*和SD/-Leu培养基上，30 ℃倒置培养3-5 d，观察菌落生长情况，如表2 表3。

注：上述为涂板法验证酵母杂交互作，梯度稀释点板法可参考本公司的Y1HGold单杂互作验证试剂盒。

7. 将转化后的重组子酵母进行PCR、测序、比对分析（或提取质粒、PCR、测序、比对分析），方法同上。

4.2.2 转录因子全长重新构建pGADT7载体回转验证

以cDNA为模板（建库时的cDNA），扩增转录因子全长，重新构建pGADT7载体，并转化Bait菌株。方法同上，验证结果如表2、表3。

总结

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