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【摘 要】
脂肪组织能分泌多种激素和细胞因子,包括瘦素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、脂联素等,这些分泌蛋白统称为脂肪细胞因子。国内外大量研究表明,在子痫前期(preeclampsia, PE)的发病机制中,脂肪细胞因子扮演了重要角色[1]。其中抵抗素(resistin)是本世纪初美国科学家在脂肪组织里发现的 一种与胰岛素抵抗密切相关的多肽类激素[2]。迄今为止,国内外有关抵抗素与PE发病关系的研究还很少见。本研究通过检测正常妊娠妇女和PE患者胎盘组织及血清中抵抗素的表达水平,探讨其表达变化在PE发病机制中的作用。
1.资料分组与标本收集:选取2006年1月至2008年1月在华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科分娩的40例正常妊娠妇女(对照组)和77例 PE患者,其中轻度子痫前期(mild preeclampsia,MPE)患者39例,重度子痫前 期 (severe preeclampsia,SPE)患者38例。PE 的诊断标准参照乐杰主编的《妇产科学》第6版。排除慢性高血压、肾脏疾病及糖尿病患者。分娩时收集胎盘标本速冻,-80 ℃保 存 备 用。同时空腹抽取孕妇肘静脉血 2 ml,留血清 -20 ℃冰箱保存待测。
2.研究方法:(1)RNA 的提取和 RT-PCR 分析:以罗氏公司 Trizol试剂盒从胎盘绒毛组织中提取细胞总 RNA。用 MBI公司 RT-PCR试剂盒进行 RT-PCR,操作均按试剂盒 说明书进行。PCR扩增cDNA 引物参照Juan等[3]设计的引物,目的产物长度364bp。用β-actin作为内参照,产物长度623bp。扩增条件:95℃变性30s,60℃退火1min,70℃延伸1min,共35次循环,最后72℃延伸10min。RT-PCR 产物经电泳、成像后进行半定量分析。(2)蛋白质的提取 和 Western印迹检测:以免疫沉淀裂解液从胎盘绒毛组织中提取总蛋白。经10% SDS-PAGE电泳,电印迹转移法转膜,封闭后加入一抗(兔抗人多克隆抗体,美国 Biovender公司)、二抗 (山羊抗兔过氧化物酶抗体,美国 Zymed公司)进行抗原抗体反应。用TBST溶液洗4次后与ECL试剂反应,胶片曝光,并进行蛋白分析。(3)ELISA法检测血清抵抗素水平:试剂盒为美国 Market公司生产。最小可测质量浓度为0.5μg/L,可测质量浓度的线性范围0.5~25.0μg/L。批内变异<6.7%,批间变异<8.9%。具体操作按试剂盒说明进行。
3.统计学分析:计量资料以均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS11.0 统计软件进行单因素方差分析和q检验,显著性水准α=0.05。
1.3组孕妇的一般情况:3组孕妇平均年龄、孕次比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。SPE组取样孕周早于对照组和MPE组 (P<0.05)。见表1。
2.3组孕妇胎盘组织抵抗素 mRNA 及其蛋白质和血清抵抗素的表达:与对照组比较,MPE 和 SPE 组胎盘组织抵抗素 mRNA 及其蛋白质和血清中抵抗素的表达水平均显著降低(P<0.05)。SPE组显著低于 MPE 组(P<0.05)。见 表1、图1~2。
2001年美国 科 学 家 Steppan 等[2]在研究胰岛素增敏剂———噻唑烷二酮衍生物的作用机制时,发现了一种由成熟 脂肪细胞特异分泌的蛋白质,有抵抗胰岛素的作用,于是命名为抵抗素。人抵抗素基因定位于19号染色体13区3带, 全长1369bp,含有4个外显子和3个内含子,外显子长度分别为36bp、128bp、78bp和236bp,全长478bp,编码序列位于47~373位,全长327bp,编码产生的抵抗素蛋白共有 108个氨 基酸残基,其含有一独特的半胱氨酸重复结构 (CX12CX8CXCX3CX10CXCXCX9CC)。人抵抗素蛋白在脂肪细胞、胎盘血液的单核细胞和骨髓组织中均有表达,在骨骼肌、血管平滑肌及内皮细胞等均无表达,但在前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中的表达量则报道不一[4]。无论妊娠与否,人腹部皮下脂肪组织中抵抗素的表达都明显高于下肢皮下脂肪组织,妊娠妇女腹部皮下脂肪组织中抵抗素的表达稍高于非妊娠正常妇女,但无统计学意义。妊娠妇女胎盘组织中抵抗素的表达最为丰富[5]。Yura等[6]比较孕3个月时终 止妊娠者的绒毛组织与正常妊娠妇女胎盘组织,发现后者抵抗素 mRNA 及其蛋白质的表达均明显高于前者。
由于胎盘能大量合成、分泌抵抗素,因此正常妊娠时孕妇血清抵抗素水平大约从妊娠第11~14周开始随着妊娠进展逐渐升 高[7]。本研究结果显示:与正常妊娠妇女比较, MPE和SPE患者血清中抵抗素的表达水平均显著降低;与 MPE患者比较,SPE患者血清中抵抗素的表达水平亦显著降低。推测 PE患者血清抵抗素水平降低可能与胎盘抵抗素基因转录及表达下调有关。
临床及实验资料表明,妊娠期全身激素水平变化及游离脂肪酸氧化增强,呈现一种生理性的胰岛素抵抗状态。胰岛素抵抗和结局性的高胰岛素血症成为正常妊娠的特征性变化,并且在妊娠晚期达到最大化。这种变化有利于为胎儿提 供更多的葡萄糖,满足胎儿生长需求,并且可以满足母体中枢神经系统对血糖水平的依赖。在生理浓度下抵抗素可以特异性抑制胰岛素对葡萄糖摄取及转运和蛋白质合成的多种作用。高水平抵抗素几乎可以完全抑制胰岛素的作用[8]。目前关于胰岛素抵抗与 PE 的关系还有很大争论[9]。本研究结果显示 PE患者血清中抵抗素的表达水平显著降低,提示 PE患者胰岛素敏感性高于正常孕妇。
抵抗素的另一重要作用是与滋养细胞本身生理功能(包括增殖、分化、侵蚀)的发挥密切相关。PE 患者的生理性血管重铸存在显著障碍,滋养细胞侵蚀仅达子宫螺旋动脉蜕膜段。正常妊娠时抵抗素主要在绒毛外细胞滋养细胞中高表达,通过诱导合成、分泌血管内皮细胞生长因子,增强基质金属蛋白酶-2的合成,抑制金属蛋白酶组织抑制剂的合成,有助于完成血管重铸[10]。而本研究结果显示:与正常妊娠妇女比较,MPE和 SPE 患者胎盘组织中抵抗素 mRNA 及其 蛋白质的表达水平均显著降低,而 SPE 患者的表达低于 MPE患者,推测低表达抵抗素的滋养细胞侵蚀能力降低,导致血管重铸障碍。
总之,胎盘滋养细胞下调抵抗素基因的转录,减少其蛋白质的表达,可能是PE发病机制中的一条重要途径。
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