温故知新​|持续吸入低浓度氧对新生大鼠肺发育 相关因子的影响

学术   科学   2024-07-03 17:01   北京  

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本文发表于《中华围产医学杂志》2010年第1期
引用格式:冯海燕,陆爱珍,王立波,等. 持续吸入低浓度氧对新生大鼠肺发育相关因子的影响[J]. 中华围产医学杂志,2010,13(01):46-49. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2010.01.013

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3、温故知新|大鼠正常胎肺发育过程中微小 RNA 的差异表达

冯海燕 陆爱珍 王立波 陈超
作者单位:200032 上海,复旦大学附属儿科医院新生儿科 
通信作者:陈超,Email:chen6010@163.com 







【摘 要】


目的   探讨持续吸入低浓度氧对新生大鼠肺发育相关因子,包括血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor-1,VEGFR1)、受体2(VEGF receptor-2,VEGFR2)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响。

方法   新生足月SD大鼠16只,随机分为对照组和实验组,每组8只。实验组生后12h开始持续吸入氧气,氧浓度为30%。对照组吸入空气。于实验开始后21d处死实验大鼠,留取肺组织标本,HE 染色观察病理改变,免疫组织化学法检测肺组织 VEGF、VEGFR1、VEGFR2和 TGF-β1蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应技术检测其 mRNA 表达。组间比较采用t检验。 

结果   与对照组相比,实验组肺组织无明显病理改变;实验组新生大鼠肺组织 VEGF、VEGFR1、VEGFR2和 TGF-β1蛋白平均累积吸光度分别为30.2±5.0、14.2±2.6、20.8±3.7和5.7±2.1,与对照组(分别为30.8±6.4、 15.6±3.4、21.7±4.5 和 5.5±2.1)比较差异没有统计学意 义 (P 均 >0.05);实 验 组 VEGF、 VEGFR1、VEGFR2及 TGF-β1mRNA 分别为对照组的1.6倍、1.6倍、2.1倍和1.1倍,差异也没有 统计学意义(P>0.05)。

结论长时间吸入低浓度氧对新生大鼠肺发育影响不明显。 

【关键词】肺;氧;血管内皮生长因子 A;受体,血管内皮生长因子;转化生长因子β1;动物,新生




肺发育障碍与新生儿支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的发生密切相关。肺发育过程受多种生长因子调控,如血管内皮生长 因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及 其受体1、2(VEGF receptor-1,VEGFR1和 VEGF receptor-2,VEGFR2) 和 转 化 生 长 因 子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)。已有研究显示,持续吸入高浓度氧气(吸入氧浓度>90%) 可使这些生长因子失衡,导致肺发育受阻和 BPD。但临床常用低浓度氧,是否也会影响这些生长因子的表达而导致肺发育障碍尚不明确,本研究旨在探讨持续吸入低浓度氧对新生大鼠肺 VEGF 及其受体和 TGF-β1表达的影响。

材料与方法
  一、实验动物与分组
  1.实验动物:新生足月 SD 大鼠(上海西普尔- 必凯实验动物有限公司提供)16只,雌、雄不拘,平均体重(54.8±2.3)g,应用随机数字表法随机分为 实验组和对照组,每组8只。 
2.动物模型:实验组:将新生SD 大鼠生后12h 即置于氧箱中,持续输入 30% 氧气 (用测氧仪监测),CO2 浓度<0.5%(用钠石灰吸收 CO2),温度 25~27 ℃,湿度50%~70%(用变色硅胶吸除水蒸 气),隔天定时开箱 0.5h,添 加水、饲料及更换垫料,并与对照组交换母鼠以避免因为氧中毒致喂养能力下降。对照组:置于室内空气中,具体方法及实验控制因素同实验组。两组大鼠均存活。 
二、研究方法 
1.标本采集:实验开始后21d所有实验动物麻醉后处死。结扎右支气管,取出右肺下叶,速冻于液氮中,随后置-70 ℃存放。通过左支气管注入4% 多聚甲醛至肺尖膨胀,取左肺置4%多聚甲醛固定液中过夜,常规石蜡包埋切片,连续5μm 切片用于 HE染色和免疫组织化学检测。
  2.新生大鼠肺组织 VEGF及其受体和TGF-β1 的检测:采用免疫组织 化学方法。一抗:兔抗 VEGF、VEGFR1及 VEGFR2多克隆抗体均购于美 国 Lab Vision公司,兔抗 TGF-β1多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。石蜡切片常规脱蜡至水,抗原修复,3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶,正常山羊血清封闭,滴加一抗,4 ℃过夜,0.01mol/L PBS 充分洗涤后加生物素标记的羊抗兔IgG抗体,37℃ 孵育30 min,加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37 ℃孵育30 min,VEGF、VEGFR1、VEGFR2及 TGF-β1的抗体稀释度均为1∶100。DAB显色,复染封片,镜下观察。结果判定以细胞浆内有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。每张切片于 Leica显微镜下(× 200)随机选取4个视野拍照,用Image-proplus 6.0 图片分析软件测定棕黄色颗粒的平均吸光度。
3.新生大鼠肺组织 VEGF 及其受体和 TGF- β1mRNA 的检测:采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)技术。采用 Trizol(美国Invitrogen公司)一步法提取冰冻肺组织总 RNA,经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测18sRNA 和28sRNA 证实其完整性后, 用 MMLV 逆转录酶逆转录为cDNA,以此为模板 进行实时荧光定量聚合酶链反应。引物(中国上海生物工程有限公司合成)序列和 PCR 反应条件见表1。

PCR 数据采用 2-ΔΔCT 相对定量方法处理。本研究中采用β-actin作为内标基因,对照组各检测指标 mRNA 的表达量作为参照因子,根据2-ΔΔCT的计算方法,实验组基因表达差异用实验组相对于对照组基因表达量的倍数表示。
  三、统计学分析 
应用SPSS13.0软件包进行统计分析,计量资 料以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。 

结 果 
持续低浓度吸氧后新生大鼠肺组织病理学改变见图1。


VEGF主要在肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞表达,支气管上皮细胞、血管平滑肌细胞和肺泡间隔内也可见表达。VEGFR1和 VEGFR2主要在支气管 上皮细胞及支气管上皮下的微血管内皮细胞表达。TGF-β1在少数巨噬细胞表达。实验组与对照组比较,VEGF、VEGFR1、VEGFR2及 TGF- 蛋白表达差异均无统计学意义。见表2 β 、3 1 。mRNA 及
讨 论 
VEGF是近年研究发现的一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子,通过膜受体 VEGFR1 和 VEGFR2介导,在生后肺发育中发挥重要作用[1]。“新型”BPD主要的病理变化是肺泡发育不良,许多影响肺泡发育进程的因素都可能导致“新型”BPD 的发生[2]。长期吸入高浓度氧已被认为是 BPD 发 生的最常见原因和最危险因素。以往有关高氧引起肺损伤的研究多集中于肺泡损伤方面,近年来,有研究提出 BPD发病的“血管假说”[3]:利用抑制血管生成的药物或 VEGF 受体拮抗剂阻止新生鼠肺部微血管发育,同时也使肺泡数目显著减少,表明肺微血管正常发育是肺泡化的必要条件。国内有研究表明,持续高氧暴露使新生大鼠肺 VEGF及其受体蛋白表达下降[4-6]。国外研究发现,高氧使新生大鼠肺 VEGF、VEGFR1和 VEGFR2mRNA 表达下降,推测VEGF可能参与了高氧介导的肺损伤,其机制可能是高氧通过阻断 低氧介导转录因子-2α-VEGF VEGFR系统的信号转导,使肺泡化受阻[7]。
 TGF-β是近年来发现的多肽类生长因子超家族,其中 TGF-β1具有代表性。体内外研究均证实正常肺发育需要克服 TGF-β1的作用;在持续吸入高氧造 成的 BPD 动物模型中,TGF-β1 表达增强[8-9]。临床研究发现 BPD患儿支气管肺泡灌洗液中 TGF-β1的水平增高[10]。肺发育过程依赖于细胞-细胞 和细胞-基质的相互作用,研究发现,由 TGF-β1介导的细胞外基质合成增加而引发的胶原等细胞外基质过多沉积于肺组织,使肺损伤修复过程中细胞外基质重建紊乱是高氧导致 BPD 的发病机制之一。 
可见,在肺发育过程中,调控肺发育的生长因子 (如 VEGF及其受体,TGF-β1)失衡,可使肺发育受阻,导致 BPD的发生。目前国内外研究多采用非常高的氧浓度(吸入氧浓度>90%),但持续吸入高氧在临床应用很少,临床上新生儿长时间用氧多见于鼻导管吸氧和箱式吸氧(氧浓度约30%),所以本研究设计了30%的氧浓度代表低浓度氧。研究结果发现,持续吸入低浓度氧对新生大鼠肺组织病理改变、VEGF 及其受体 和 TGF-β1 的蛋白及 mRNA 表达无明显影响,提示长时间吸入低氧对肺发育影响不明显。既往研究发现持续吸入中等 (氧浓度为50%)及较高浓度氧(氧浓度为75%)均使新生大鼠肺组织 VEGF 及其受体 mRNA 表达下降,提示中等及较高浓度氧可能通过抑制肺血管的发育导致 BPD的发生。有证据表明,长时间吸氧即使氧浓度有轻微升高,也可影响肺脏病理[11]。所以,临床上新生儿需长时间吸氧时,应尽量维持较低浓度吸氧,以免造成肺损伤,使肺发育受阻,导致 BPD 的发生。



参考文献
 
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