青年文摘丨多功能抗CRISPR 蛋白AcrIF24的对I-F型CRISPR-Cas系统的抑制研究

文摘   科学   2024-07-15 08:02   北京  


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摘译:杨杨

审校:苏佳纯

CRISPR-Cas系统是原核生物适应性免疫系统,噬菌体使用抗CRISPR蛋白(Acrs)来对抗这些系统。2022年,北京化工大学生命科学与技术学院的团队报告了AcrIF24及其与crRNA引导的监视(Csy)复合体的结构。

据文献报道,抗CRISPR 相关基因(Aca)家族的标志性特征之一就是有保守的HTH结构域,并借此结构域来发挥转录调控抑制功能。因为在acrIF23-24的操纵子上,未发现相关Aca基因,且在AcrIF24的C端预测到HTH结构域,故推测AcrIF24既可以发挥Acr的功能,同时也发挥Aca的功能。

图1 AcrIF24同源基因上游启动子中的保守反向重复序列
为此,研究人员首先在acrIF23-24操纵子的启动子区域搜索到了一段保守的反向重复序列IR23-24,位于-35和-10区之间(图1)。并通过电泳迁移率分析实验(EMSA)来验证AcrIF24和IR23-24的互作。结果显示,AcrIF24可以和IR23-24以浓度依赖性的方式结合,且随着浓度的升高,会产生非特异性结合条带。当反向重复序列的碱基序列改变,特异性结合消失,但非特异性结合仍然存在(图2)。

图2 EMSA——用于检测AcrIF24与IR23-24和突变型IR23-24的结合亲和力
随后,研究人员使用β-半乳糖苷酶系统进行了转录测试。将β-半乳糖苷酶系统的启动子区域替换为IR23-24,同时转入一个新的工程质粒来表达AcrIF24。结果表明,IR23-24确实是Acr启动子,且AcrIF24抑制了该启动子的转录(图3)。故此,AcrIF24的Aca身份得到证实。

图3 铜绿假单胞菌PA14菌株β-半乳糖苷酶活性测定

在后续AcrIF24的anti-CRISPR功能的研究中,研究人员发现,AcrIF24可诱导非特异性dsDNA与Csy复合体结合。EMSA实验结果显示任何浓度的AcrIF24都没有抑制目标dsDNA的结合,但在较高的AcrIF24浓度下观察到了一条清晰的条带,与Csy-dsDNA复合体相比,其大小有所增加(图4,左半)。这一结果表明形成了一个三元络合物(即csy-AcrIF24-dsDNA)。

图4 用EMSA检测AcrIF24的非特异性DNA结合的诱导作用
dsDNAsp
为目标dsDNAdsDNAns为非特异性dsDNA
为了确定csy-AcrIF24复合体如何招募dsDNASP,研究人员通过将纯化的共表达的csy-AcrIF24复合体与dsDNASP孵育来纯化csy-AcrIF24复合体,并以3.02埃的分辨率求解其结构(图5)。电镜结果分析表明,dsDNASP既结合在Cas8f亚基的钩区上,也与复合体中的AcrIF24的C-端区域上方结合。AcrIF24通过与多达5个Cas7f亚基(Cas7.2f-7.6f)结合来靶向Cas7f亚基(图6),立体地阻止互补靶DNA对crRNA的连接,并诱导非序列特异性DNA与csy复合体结合。

图5 Csy-AcrIF24-dsDNA复合体的冷冻电镜结构

图6 AcrIF24结合多个Cas7f亚基的冷冻电镜结构

总之,该研究表明,AcrIF24是一个具有三层抑制作用的Acr(即一次失活两个Csy复合体,防止DNA-crRNA杂交和诱导非特异性DNA结合)

【参考文献】

Yang L, Zhang L, Yin P, Ding H, Xiao Y, Zeng J, Wang W, Zhou H, Wang Q, Zhang Y, Chen Z, Yang M, Feng Y. Insights into the inhibition of type I-F CRISPR-Cas system by a multifunctional anti-CRISPR protein AcrIF24. Nat Commun. 2022 Apr 11;13(1):1931. doi: 10.1038/s41467-022-29581-1. PMID: 35411005; PMCID: PMC9001735.



     该研究发现和解析了AcrIF24的作为Acr和Aca的双重功能以及对I-F型 CRSRPR-Cas 系统的抑制机制,拓展了对细菌和噬菌体的互作机制新的认知。

华山抗生素所
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