作为食源性病原体，蜡样芽孢杆菌不仅产生污染食物、威胁人体健康的毒素，还依靠孢子抵抗极端环境。由于受气候、土壤、种植及储存环境影响，小麦易受到微生物的污染，继而被引入成品馒头。食品中的蜡样芽孢杆菌超过105CFU/g就会产生致呕吐型毒素和致腹泻型毒素，因此蜡样芽孢杆菌的超标常导致食源性疾病暴发。金黄色葡萄球菌也是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于环境中。感染金黄色葡萄球菌的患者在感染后的6～48h内，通常会出现呕吐、腹泻、恶心、腹部绞痛等症状。金黄色葡萄球菌在米面制品中分布广泛。
蘑菇醇又名1-辛烯-3醇，分子式C8H16O，为脂肪族不饱和醇，呈无色至淡黄色油状液体，是使蘑菇呈现香味的主要成分。自然界中主要存在于薄荷类、百里香及鲜蘑菇中，属天然等同香料，在GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定为允许使用的食用香料。蘑菇醇是馒头中的主要呈香物质之一，由面团中的乳酸菌发酵产生，对馒头香味有积极贡献。有研究表明，蘑菇醇在控制病原体方面具有潜在的应用前景。
01
结果与分析
最低抑菌浓度（MIC）和
最低杀菌浓度（MBC）值
MIC和MBC是评价抑菌剂对特定微生物抑制和杀死效果的常用指标，常用于抑菌剂的研究中。选用馒头中常见的2种细菌金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢为指示菌，测定了蘑菇醇溶液的体外抑菌效果。由图1可知，蘑菇醇对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的MIC为1mg/mL，MBC为2mg/mL。在面米制品中，主要防腐剂添加量为脱氢醋酸钠0.3～0.5g/kg、丙酸钙2.5g/kg、山梨酸钾1g/kg，但它们均为化学合成且单独使用效果不佳，需要复配使用才能达到最佳效果，而使用少量的蘑菇醇即能达到抗菌效果。青花椒精油对蜡样芽孢杆菌的MIC和MBC分别为2.0、4.0mg/mL。研究发现辣木籽抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为4mg/mL和8mg/mL。研究发现细叶小檗果小檗碱对金黄色葡萄球菌的MIC为3.30mg/mL。以上结果表明，蘑菇醇对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌具有优异的抑菌性能。Tween-20为水包油(O/W)型乳化剂，加入蘑菇醇溶液中会略微增加吸光度值，所以4 mg/mL的蘑菇醇溶液OD600相比2、1mg/mL的吸光度值略大，但与阳性吸光度值差异明显，对结果影响较小。
牛津杯法验证
由表2可知，蘑菇醇对2种常见细菌均有抑制作用，且抑菌效果随着其浓度增加而增强。在平板上，与对照相比，1mg/mL蘑菇醇具有明显的抑菌圈，MIC和MBC浓度的蘑菇醇对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到7.16mm和10.86mm，对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到了6.36mm和9.42mm，与吸光度的结果相一致。进一步说明1mg/mL浓度的蘑菇醇对细菌有抑制效果，2mg/mL的蘑菇醇浓度对细菌有杀伤效果。
流式细胞分析仪（FCM）
检测蘑菇醇杀菌能力
Calcein AM和PI对蘑菇醇处理的细菌进行联合双重染色观察，根据Calcein AM/PI差异染色特征鉴定亚群，可检验细胞是否进入亚致死状态。第一象限(Q1-2)限对应亚致死细胞，具有亚致死损伤，伴有残留酯酶或裂解细胞；第二象限(Q1-1)对应死亡细胞；第三象限(Q1-3)对应细胞碎片或者未染色细胞；第四象限(Q1-4)对应完整细胞，具有高酯酶活性和完整的膜。
由图2可知，经蘑菇醇处理以后的4个象限发生了动态变化，说明细胞状态发生转变。用1mg/mL浓度蘑菇醇处理过的金黄色葡萄球菌死亡细胞和受损细胞由27.37%上升到90.83%，其中死亡细胞增加了4.61%，损伤细胞增加了58.85%；蜡样芽孢杆菌死亡细胞和受损细胞由25.97%上升到93.14%，其中死亡细胞增加了0.59%，受损细胞增加了66.58%。FCM的检测结果显示，MIC浓度的蘑菇醇处理过后使得PI染料穿过破损细胞膜进入细胞，增加了受损细胞的百分比。
细胞膜渗透性观察结果
倒置荧光显微镜用于观察蘑菇醇处理后对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌细胞膜完整性和通透性的影响。由图3可知，经过PI染色后可区分细胞膜完整的细胞和膜受损细胞，PI会进入细胞膜破损的细胞并将其染成红色，而活细胞则不会被染色。未经蘑菇醇处理的空白对照组(图3A、图3C)细胞样品染色后红色荧光较少，而经过1mg/mL蘑菇醇处理2 h后的样品中红色荧光增强，说明经过蘑菇醇处理后金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的细胞膜遭到破坏(图3B、图3D)，通透性有所增加。倒置荧光显微镜进一步验证了蘑菇醇处理对细胞膜具有破坏作用，从而导致细菌活性降低或失活。
不同浓度的蘑菇醇对
微生物数量的影响
刚蒸制完成的馒头中微生物主要来源于原料和加工冷却过程中引入的耐热菌数目，且馒头富含营养物质，非常适宜微生物生长繁殖。因此，微生物在刚制作完成的馒头中迅速生长繁殖，并迅速在24h达到5 lgCFU/g，此后，由于基质的消耗以及菌群的竞争，增殖速度逐渐减缓。微生物在馒头中的生长曲线与在基质中生长曲线类似，呈S形。
由图4A、图4B可知，馒头表皮的菌落总数起始值在2.15～2.31 lgCFU/g，同时期的馒头内部的菌落总数低于馒头表皮的菌落总数，馒头内部比馒头表皮低1.56～2.68 lgCFU/g。馒头在保存过程中水分一直在流失，在表皮形成了较低的水分活度。面包中较低的水分活度会在其表面形成一层硬壳，从而能阻止微生物进入内部繁殖，馒头表皮菌落总数高于内部的原因可能与之相同。霉菌/酵母菌起始数量低于2 lgCFU/g，直至36h仍处在较低水平，在2.00 lgCFU/g以下，且在60h内保持在3.00 lgCFU/g。MIC浓度的蘑菇醇馒头表皮与内部的菌落总数和酵母/霉菌数量生长均低于其他组和对照馒头。在整个保藏过程中，蘑菇醇馒头菌落总数总是低于对照馒头，这说明蘑菇醇馒头对微生物具有抑制作用。在储藏期间，相比对照最多降低了2.65 lgCFU/g菌落总数，1.80 lgCFU/g的霉菌/酵母菌数量。常温储存72h后馒头外观图见图5。
不同浓度的蘑菇醇对
比容的影响
馒头比容表征单位质量的馒头体积，是影响馒头品质的重要原因之一。由图6可知，所有馒头的比容均超过小麦粉馒头中＞1.7的国家标准，MIC添加量蘑菇醇的馒头与对照馒头的比容具有显著差异(P<0.05)，添加MIC的蘑菇醇的馒头比容最大，可能是因为1mg/mL的蘑菇醇抑制了细菌的活性，但远低于酵母抑制其最低抑菌浓度8mg/mL，从而使得细菌菌群的竞争力减弱，酵母竞争力增强。添加1/2和1/4MIC蘑菇醇之间的馒头比容没有显著性差异，对照组的比容最低为1.94。
不同浓度的蘑菇醇
对质构特性的影响
馒头质构分析可采用质地性状和压缩张弛性综合指标。质地性状与馒头品质成负相关，数值越大，表示馒头越硬度大且黏牙，计算方式为硬度、黏性与咀嚼性的乘积。压缩张弛性与馒头品质呈正相关，数值越大，表明馒头越有弹性、口感越好且有嚼劲，计算方式为弹性、内聚性与回复性的乘积。由表3可知，质地性状1/4MIC(3.0×109)＞对照(4.4×107)＞1/2MIC(2.9×108)＞1MIC(6.9×107)，添加量MIC浓度蘑菇醇的馒头质地性状最好。压缩张弛性1MIC(0.44)＞1/2MIC(0.43)＞1/4MIC(0.41)＝对照(0.41)，添加量1MIC浓度蘑菇醇的馒头压缩张弛性最好。
02
感官评价
有研究表明，TPA测试能够使品尝指标量化，便于数据处理和分析，且测试数据与感官评价具有显著相关性。高品质的馒头不仅要求外观饱满、光滑、色泽均匀，还要求内部气孔分布均匀，质地致密，纹理清晰且呈现出海绵状的结构。对4组发酵的馒头分别从表皮色泽、内部组织、比容、弹性、气味5个方面进行感官评价。由图7可知，4组馒头感官评价显示，蘑菇醇浓度为1mg/mL时，馒头评价得分最高，为91分，与质构测试结果一致。除在馒头气味得分方面略差，其他指标表皮色泽、内部组织、比容、弹性等均为最高分。蘑菇醇属天然等同香料，因具有浓烈的蘑菇香味、薰衣草、玫瑰和干草香气，可赋予馒头特殊香味。但因个体差异不同，部分感官评价人员对此味道的接受性较差，因此可作为差异化产品补充市场。
03
结论
经二倍稀释法测定和牛津杯法验证，蘑菇醇对所测试的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌具有抑制作用。MIC为1mg/mL，MBC为2mg/mL，对所测细菌具有优异的抗菌效果。经MIC浓度的蘑菇醇处理后FCM结果显示指示菌受损细胞比例大幅增加，倒置荧光显微镜显示红色荧光增强，进一步验证，蘑菇醇对细胞膜有破坏作用，可使其活性降低或失活。以1mg/mL将其添加到馒头中，可以显著降低馒头中细菌总数和霉菌/酵母菌数量、增大比容、降低硬度，使馒头拥有特殊香味，感官评价得分最佳。综上所述，蘑菇醇作为天然成分为常温馒头保鲜提供了一种新的方式。
参考资料：
[1]周伟涛，郑 琦，王晓杰，等．蘑菇醇的抑菌活性及其在馒头保鲜中的应用[A]．食品科技.2024,49(7):147-155.
