【专家共识】非小细胞肺癌 BRAF V600E 突变免疫组织化学检测中国专家共识

我国肺癌的发病率和病死率均位居恶性肿瘤的首位,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占85%。BRAF是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellularsignal regulated kinases, ERK)信号通路的关键调节因子。NSCLC中BRAF基因突变率为1.5%~5.5%，其中以BRAF V600E突变(Ⅰ类突变）为主，占所有BRAF基因突变的30%~50%。BRAF突变NSCLC患者预后不良，且常规的化疗或免疫治疗临床获益有限。国内外临床研究显示：BRAF抑制剂（达拉非尼）与丝裂原活化细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制剂（曲美替尼）联用，在初治和经治的BRAF V600E突变的晚期NSCLC患者中均显示良好的疗效及生存获益。基于此，该联合疗法已获得中国、美国、欧洲、日本等多个国家和地区的批准，用于治疗BRAF V600E突变的转移性NSCLC，并纳入国内外权威指南推荐。

免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)可以在蛋白水平检测BRAF V600E基因突变状态，相比于RT-PCR和NGS等分子检测，IHC具有平台普及率高、检测费用低、检测难度低、检测周期短等优势，且国内外多项研究结果显示，使用IHC(VE1单克隆抗体）检测BRAF V600E突变与RT-PCR/NGS等分子检测对比，其灵敏度、特异性和一致性均较高，因此目前多瘤种指南、专家共识都推荐IHC可作为筛选BRAF靶向治疗潜在获益人群的补充筛查手段。

1 BRAF基因突变检测的临床意义

1.1  分子检测作为伴随诊断筛选BRAF靶向治疗潜在获益人群

全球注册研究结果显示，达拉非尼联合曲美替尼一线治疗晚期BRAF V600E突变阳性NSCLC患者的客观缓解率(overall response rate, ORR)为64%，中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)为14.6个月，中位总生存期(overall survival, OS)为24.6个月;二线及后线治疗研究者评估的ORR为68.4%，中位PFS为10.2个月，中位OS为18.2个月；5年随访数据显示：一线治疗组的4年和5年生存率分别为34%和22%，后线治疗组的4年和5年生存率分别为26%和19%。基于此研究数据，FDA批准达拉非尼联合曲美替尼用于治疗BRAF V600E突变的转移性NSCLC，并批准FoundationOne CDx和Oncomine Dx Target Test为伴随诊断。中国注册研究中，达拉菲尼联合曲美替尼全线治疗BRAF V600E突变阳性NSCLC患者的ORR为75%，中位PFS和中位OS尚未达到；真实世界数据比较达拉非尼联合曲美替尼、化疗及免疫检查点抑制剂一线治疗BRAF突变晚期NSCLC患者，达拉非尼联合曲美替尼治疗组的中位PFS为25个月，12个月的PFS率为67%，24个月的PFS率为52%。NMPA批准达拉非尼联合曲美替尼用于治疗BRAF V600E突变的转移性NSCLC，未同步批准BRAF基因突变伴随诊断产品，但已有多个包含BRAF基因的NGS或RT-PCR检测产品获得NMPA批准。

1.2  IHC检测可作为补充筛查手段协助筛选BRAF靶向治疗潜在获益人群

IHC是病理诊断常规检测之一，具有平台普及率高、检测周期短、成本低等优势。目前，国内外多项研究结果显示，IHC(VE1单克隆抗体）检测BRAF V600E突变与分子检测一致性高。因此，NCCN皮肤黑色素瘤指南(2023)表示IHC(VE1单克隆抗体）可用于大规模初筛以确定BRAF突变状态；NCCN结肠癌指南(2022)指出，IHC可作为BRAF V600E突变检测的可选项用于药物治疗指导；NCCN NSCLC指南(2023)指出，IHC检测BRAF V600E已有一些研究证据，但开展前需经过广泛的实验室验证；《中国晚期非小细胞肺癌BRAF突变诊疗专家共识》指出IHC可作为BRAF突变检测的补充筛查方法。

2 NSCLC BRAF IHC检测的适用人群

2.1  晚期NSCLC患者

3 NSCLC BRAF IHC检测适用的

标本类型

临床实践中BRAF IHC检测的样本类型包括组织学样本和细胞学蜡块样本。目前，国内外关于BRAF IHC检测与分子检测一致性研究大多使用组织学样本（包括活检样本及手术切除样本），结果显示BRAF IHC(VE1单克隆抗体）检测与分子检测一致性高，灵敏度为90.5%~100.0%，特异性为95.2%~100.0%；仅有个别研究使用细胞学蜡块样本：一项研究针对201例初诊为NSCLC病例的恶性胸腔积液细胞学蜡块样本进行BRAF IHC(VE1单克隆抗体）检测，其中171例同时进行了NGS检测(NGS检测BRAF V600E阳性病例仅有7例），与NGS检测结果相比，BRAF IHC检测的灵敏度、特异性和一致性均为100%。但由于针对细胞学蜡块样本进行BRAF IHC一致性的研究有限，且现行研究纳入的阳性病例数极少，使用细胞学蜡块样本进行BRAF IHC检测的可靠性尚有待开展大样本研究进一步验证。

4 BRAF IHC检测的试剂和平台

4.1  检测试剂

目前国内外尚无BRAF IHC伴随诊断抗体获批，已备案抗体中仅1个VENTANA anti-BRAF V600E(VE1)获得了NMPA医疗器械备案(Ⅰ类）；另外有超过40个抗体完成了省级备案。目前国内外已经发表的一致性研究中，BRAF IHC检测主要使用的是VE1抗体。针对不同抗体之间的比较目前尚缺乏相关数据。

4.2  检测平台

IHC检测自动化平台包括VENTANA BenchMark(ULTRA/GX/ULTRA PLUS)、Dako Autotimer Link48、Leica BondⅢ/Max平台。BRAF IHC检测采用VENTANA anti-BRAF V600E(VE1)抗体联合OptiView DAB IHC Detection Kit,临床实践中主要使用VENTANA BenchMark ULTRA平台检测。

共识5：推荐使用VENTANA anti-BRAF V600E(VE1)抗体联合OptiView DAB IHC Detection Kit进行BRAF IHC检测，检测平台为VENTANA BenchMark平台。选择其他抗体及检测平台需进一步的研究数据支持。

5 NSCLC BRAF IHC检测的判读标准

5.1  限定阳性细胞占比和着色强度

Hofman等的研究中将VE1抗体阳性定义为=80%肿瘤细胞胞质强着色(3+)，任何形式的细胞核着色均为阴性，结果显示21例经NGS/焦磷酸测序确定为BRAF V600E突变的病例IHC结果均为阳性。

Sasaki等和Gow等将VE1抗体阳性结果定义为=50%肿瘤细胞胞质阳性，不区分着色强度。Sasaki等的研究中5例分子检测为BRAF V600E突变的病例IHC结果均为阳性[2例表现为3+（=90%肿瘤细胞胞质阳性），1例表现为2+（=90%肿瘤细胞胞质阳性），2例表现为1+（=50%肿瘤细胞胞质阳性）］；Gow等的研究中29例RT-PCR/Sanger检测为BRAF V600E突变的病例中28例IHC结果判定为阳性，1例(1+)阳性肿瘤细胞约10%IHC结果判读为阴性导致假阴性结果。

Ilie等、Garcia等和Yuan等研究将VE1抗体阳性结果定义为肿瘤细胞胞质弥漫颗粒状着色。其中Garcia等在此基础上另将高背景着色、弱和（或）灶状胞质着色定义为不确定结果，结果显示171例中存在6例不确定结果，其中2例分子检测确定为存在BRAF V600E突变，4例BRAF V600E突变阴性；2例分子检测阳性病例IHC结果均为胞质弱着色。Yuan等采用二元判读标准（不限定阳性细胞占比和阳性着色强度），对比“=80%强阳性”及“=50%阳性”两种阳性判读标准，使用二元判读标准判读准确性更高，灵敏度和特异性均为100%(406例手术切除样本），AUC值为1.000（后两种标准灵敏度分别为42.4%和92.4%;AUC值分别为0.712和0.962)。

根据上述多项研究结果可见NSCLC中使用VE1抗体检测的BRAF V600E突变病例多为胞质弥漫颗粒状着色，弱至强着色均可出现，少数病例尽管着色强度弱或呈局部区域着色，只要是特异性着色均应视为阳性结果；对阳性肿瘤细胞占比或者着色强度的限制在一定程度上会导致假阴性结果的存在。因此，结合国内多中心研究及临床实践，推荐使用二元法对BRAF IHC(VE1单克隆抗体）检测结果进行评估，阳性结果定义为：肿瘤细胞质特异性弥漫颗粒状着色（图2)；阴性结果定义为肿瘤细胞胞质无着色、非特异性着色或其他定位不当的着色（图3)。

共识6：推荐NSCLC采用VENTANA anti-BRAF V600E(VE1)抗体进行BRAF IHC检测，结果采用二元法（阳性／阴性）判读；阳性标准：肿瘤细胞胞质特异性弥漫颗粒状着色，无论着色强度和（或）阳性占比；肿瘤细胞胞质无着色、背景非特异性着色及任何定位不当（细胞核阳性或细胞核质均阳性以及黏液着色）均为阴性结果。

6 IHC检测BRAF V600E突变与分子

检测的一致性

6.1  NSCLC中BRAF IHC检测的灵敏度

NSCLC中BRAF IHC检测特异性较高，文献报道的特异性范围为95.2%~100.0%。VE1抗体特异性识别BRAF V600E突变蛋白，对BRAF野生型、BRAF非V600E突变及其他NSCLC常见驱动突变极少有交叉反应。各研究汇总数据参见表1。

7 BRAF IHC检测的质控要点

7.1.3检测后  (1)准确的结果判读：在正式结果评估前，仔细评估阳性对照组织、阴性对照组织及阴性试剂对照是否合格，对照染色合格的情况下，依据二元法判读标准对IHC切片进行评估，注意定位不当着色及背景非特异性着色的干扰；(2)严格的判读培训：既往研究及临床实践过程中突出存在的判读问题表现为对肿瘤细胞胞质弱着色、定位不当着色以及背景非特异性着色的把握，为避免假阴性及假阳性结果的产生，判读医师应在正式参与BRAF IHC结果报告前接受严格的判读培训，仔细把握判读要点及可能存在的判读陷阱；(3)规范化报告：采用二元法判读标准进行结果报告，即阴性或阳性，建议同时对对照组织染色情况进行报告，如BRAF V600E(VE1)：阳性（对照组织染色良好）。如使用非VENTANA anti-BRAF V600E(VE1)抗体进行检测，在报告中需备注说明。

实验室应定期参加室间质评活动，确保检测流程的规范性和检测结果的准确性。

共识7:BRAF IHC检测应严格遵照商业化试剂盒说明书要求规范化检测，设置阳性对照组织、阴性对照组织及阴性试剂对照。建议阳性对照组织及阴性对照组织与待检组织切片捞至同一张玻片上运行，临床批量检测的情况下，每一轮检测至少包含一张阴性试剂对照。BRAF IHC检测判读医师应在正式参与BRAF IHC结果报告前接受严格的判读培训；规范化报告，建议同时对对照组织染色情况进行报告并注明所使用的抗体。 

8 BRAF IHC检测其他注意事项

本共识编写专家组成员（按单位名称汉语拼音顺序排序）：安徽医科大学附属第一医院（樊祥山）；北京大学肿瘤医院（王子平、杨欣）；北京医院／国家老年医学中心（王征）；福建医科大学附属肿瘤医院（陈刚、林根、黄榕芳）；复旦大学附属肿瘤医院（樊窼、李媛）；广东省人民医院（张庆玲）；国家癌症中心／国家肿瘤临床医学研究中心／中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院（王志杰、应建明、袁培）；国家癌症中心／国家肿瘤临床医学研究中心／中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院山西医院（段建春、郗彦凤）；国家癌症中心／国家肿瘤临床医学研究中心／中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院深圳医院（黄文亭）；哈尔滨医科大学附属肿瘤医院（孟宏学）；河北医科大学第四医院（丁翠敏、刘月平）；湖北省肿瘤医院（岳君秋）；湖南省肿瘤医院／中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院（邬麟）；南京医科大学第一附属医院（张智弘）；山东大学齐鲁医院（高鹏、李际盛、戚美）；上海市胸科医院／上海交通大学医学院附属胸科医院（韩昱晨、李子明）；首都医科大学附属北京朝阳医院（路军）；四川大学华西医院（田攀文）；四川省肿瘤医院（刘洋、侯俊）；天津医科大学附属肿瘤医院（孙蕾娜）；同济大学附属上海市肺科医院（任胜祥、武春燕）；西安交通大学附属第一医院（姚煜、张冠军）；新疆医科大学第一附属医院（张巍）；浙江大学医学院附属第一医院（滕晓东、周建英）；郑州大学第一附属医院（李文才、高献争）；郑州大学附属肿瘤医院／河南省肿瘤医院（马杰）；中国医科大学附属第一医院（李庆昌、王亮）；中南大学湘雅医院（胡成平、周建华）；中山大学肿瘤防治中心（方文峰）

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