【综述】乳腺癌PIK3CA突变的临床意义及其检测研究进展

1.2 PIK3CA基因在乳腺癌中的热点突变

乳腺癌患者中，70%~80%的PIK3CA基因突变发生在位于9号外显子的p.E545K、p.E542K和20号外显子的p.H1047R,其PIK3CA突变与致癌作用密切相关。9号外显子突变位点位于p110α的螺旋结构域，使其能够避免p85的抑制性调节，最终促进肿瘤的发生、发展。20号外显子突变位于激酶结构域，但具体机制目前尚不明确。根据来自癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中乳腺癌和癌症体细胞突变目录（the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer,COS-MIC)中数据显示，PIK3CA中其他具有致病性但频率较少的位点突变包括位于4号外显子的p.N345K突变、13号外显子的p.E726K取代、20号外显子的p.G1049R、9号外显子的p.Q546K、p.Q546R、p.E545A、p.E545A以及7号外显子的p.C420R。新的检测技术可能会检测出更多的突变位点，其与临床疗效的相关性需要大样本量的进一步确认。目前经临床试验数据证实的与PI3Kα抑制剂疗效相关的位点突变如图2所示。

1.3 乳腺癌中PIK3CA突变的临床意义

1.4  PI3K 抑制剂在乳腺癌中的研发进展

PI3K抑制剂在临床实践中已经有过多重迭代。第一代抑制剂即泛PI3K抑制剂，可作用于所有的PI3K I 类异构体( α、β、δ或 γ) 如buparlisib(BKM120)和pictilisib(GDC-0941) , 其通过影响下游靶点而具有广谱的抑制活性，因此靶点外毒性的风险有所增加。第二代为亚型选择性抑制剂，仅作用于特定的亚型异构体，如PI3Kα选择性抑制剂Alpelisib。SOLAR-1研究比较了Alpelisib联合氟维司群治疗PIK3CA突变的HR+/HER2-晚期或转移性乳腺癌患者。该研究纳入572例患者，对患者随机进行Alpelisib联合氟维司群治疗(169例）或安慰剂联合氟维司群治疗(172例）。主要研究终点显示Alpelisib组患者PFS时间显著长于安慰剂组，中位PFS时间分别为11.0个月和5.7个月(P<0. 001) 。因此，2019年5月Alpelisib获得美国食品药品管理局( Food  and Drug Administration,FDA)批准，可联合氟维司群治疗绝经后HR+/HER2-且PIK3CA突变的晚期或转移性乳腺癌患者。第三代PI3Kα抑制剂Inavolisib,目前被确立为一线治疗的高选择性PI3Kα特异性抑制剂和突变体降解剂，Inavolisib选择性抑制PI3Kα的催化亚基p110α,对PI3Kα的选择性是其他PI3K亚型(β、δ、γ)的300倍以上，同时降解PI3K突变体，实现PI3K/AKT通路持续抑制，与其他PI3K抑制剂相比显著降低药物毒性。Ⅲ期临床INAVO120研究纳入经组织或循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)检测确定存在PIK3CA突变的325例患者，结果显示Inavolisib组，中位PFS延长了7.7个月（分层HR=0.43 ,95%CI0.32~0.59;P<0.0001) ,显著降低了57%的疾病进展或死亡风险，基于此，Inavolisib也获得了FDA和NMPA的突破性疗法认证。目前已开展多项针对乳腺癌不同亚型(HR+、HER2+和TNBC) 及不同疾病阶段（早期、晚期／转移性）的临床研究。部分研究结果信息见表1 。

2.2 PIK3CA 突变标本类型选择

    研究显示，无论是血浆ctDNA还是肿瘤组织检测的PIK3CA突变患者，均可从PI3K抑制剂治疗中获益。但是不同的送检样本，在临床检测PIK3CA突变时仍存在一定差异。ctDNA检测具有无创或微创，可反复取材，收集、处理和分析报告周转时间( turnaround time , TAT)短等优势，同时能克服肿瘤空间异质性，可相对全面、实时地反映患者的肿瘤分子特征。鉴于目前尚缺乏针对同时期血浆和肿瘤组织检测一致性的大样本研究，故建议对血浆ctDNA检测 PIK3CA 突变阴性的患者送检肿瘤组织。一项纳入341例PIK3CA突变人群的研究分析显示，99% 的患者通过肿瘤组织样本检测出PIK3CA突变；在317例有血浆样本且PIK3CA突变人群中，通过血浆ctDNA样本可检测出 56% 的PIK3CA 突变。考虑到血浆样本检测的便利性及较高的假阴性率，目前多个指南或共识均建议对血浆ctDNA检测后PIK3CA突变阴性的患者重新进行肿瘤组织检测，以提高突变的检出率。

    PIK3CA突变状态的分布在原发肿瘤和转移瘤中大致相似，可使用活检组织样本或存档组织样本。若存在新鲜活检组织样品，则优先选择新鲜石蜡包埋肿瘤组织进行检测，如无法获得新鲜活检组织样品，再考虑以往石蜡包埋肿瘤组织或切片等。虽然PIK3CA突变可以在不同时期乳腺癌中发现，但由于转移性乳腺癌患者治疗中可以产生获得性PIK3CA突变，因此需要检测最新的肿瘤组织样本以获取 PIK3CA突变信息，如果无法获取组织样本则首选ctDNA检测。

    目前常用的PIK3CA突变检测方法包括NGS、PCR、Sanger 测序、微滴式数字PCR (droplet digital PCR , ddPCR) 、数字 PCR-流式技术( BEAM- ing)等，不同检测方法存在一定差异。

2.3.1 NGS 检测 NGS 又称下一代测序技术、二代测序技术、高通量测序技术，通常可使用肿瘤组织或液体标本（如血浆ctDNA标本等），用于肿瘤的临床诊断、基因组学检测。NGS可检测到PIK3CA常见突变及一些罕见突变，常见的突变分别为p. H1047R、p. E545K、p. E542K , 罕见突变为 p. N345K（外显子 4) ;p. H1047L（外显子 20) ;p. E726K（外显子 13) ;p. C420R（外显子 7) ;NGS 也可以检测到中国人群中的 PIK3CA 新突变位点，包括 p. V344_V346dup（外显子 4) ; p. E418 _ L422 > V、p. P449 _ E453 > Q、p. P449 _ V461del、p. P449S（外显子 7) ;p. E798N（外显子 15) ;p. Q861fs（外显子 17) ;p. E976K（外显子 19) ;p. A1066fs（外显子 20)。基于ctDNA NGS 可检测到激酶结构域、螺旋结构域及其他结构域中的PIK3CA突变位点。2020 年 10 月美国FDA批准了基于NGS的液体活检伴随诊断产品F1LCDx用于检测PIK3CA突变。

2.3.3 其他基因检测方法 Sanger测序又称一代测序，因其可靠性、可及性和相对较低的成本等优势，Sanger测序成为生物学标志物突变检测的金标准，但该方法的灵敏度较低。一项纳入 60 例FFPE乳腺样本的研究通过PCR-MS、LNA-PCR测序和标准Sanger测序三种方法，分别评估了乳腺病变中PIK3CA热点突变状态(E542 、E545和H1047) , 其中PCR-MS检测出 48 例患者存在一种或多种PIK3CA突变 (14 例E545K , 1 例E545G , 4 例E542K , 25 例H1047R, 1 例同时具有E545K和E542K, 1 例同时具有E542K 和H1047R , 1 例具有E545K 和 H1047R均为E545K和H1047R , 1 例为E545K和Q546E) , 12例为野生型，与PCR-MS相比，Sanger测序仅检测到 69% 的突变，包括H1047R、E545K、Q546E, 检出率显著低于PCR-MS, 且 4 例共突变均未检出。Sanger测序一次可以读取600 ~ 1000bp的碱基，准确性高，但仍具有测序的长度限制、通量低的局限性。