【专家论坛】乳腺叶状肿瘤病理诊断标准的思考与实践经验

叶状肿瘤(phyllodes tumour,PT)是指具有叶状结构和间质过度增生的一类乳腺纤维上皮性肿瘤(fibroepithelial tumours),其分类在WHO框架下被细化为良性、交界性及恶性三类，亦有学者倡导采用简化的低级别与高级别分类体系。目前对PT的病理诊断和肿瘤分类具有一定的主观性，且这类肿瘤因其间质细胞具有非限制性生长及潜在浸润能力，使得其临床转归难以精确预测。“叶状结构形成”和“间质过度生长”不仅是WHO定义PT的必要条件，也被认为是区别于纤维腺瘤(fibroadenoma,FA)的主要形态学特点。

既往认为该肿瘤的发病率较低，亚裔患者发病率高于西方。然而，近年国内单中心研究报道，PT的诊断比例呈不断上升趋势,但不同病理中心以及不同病理医师之间诊断PT的一致性和重复率差异较大。尤为值得注意的是，部分初诊为FA的病例，在完整切除后出现局部复发乃至转移，复发后的病理形态典型地呈现出PT特征，这显然与FA不具有非限制性生长和浸润潜能的特征不符合。近期，有研究对WHO乳腺肿瘤分类中PT章节所引用的文献进行了质量评估，揭示出多数文献证据水平不高，进而引发了对PT认知及诊断标准局限性的深思。一项关于PT的在线问卷调查显示，约半数病理医师每年诊断10~50例PT,其中大多数专家(84.3%)认为间质细胞密度增加是诊断的关键，59%专家认为叶状结构的出现是最重要的，而70%专家将患者年龄视为鉴别FA和PT的重要因素。这说明有关PT的病理诊断标准尚未形成广泛共识，不同的病理医师尚保留有各自的判断和取舍。多机构回顾性研究进一步揭示了依照现有WHO标准诊断PT可能导致的漏诊问题，特别是那些具有潜在远处转移风险的恶性PT病例。这一发现促使研究者们提出了一系列修订建议,并在实践中验证了新提出的恶性PT的改良诊断标准优于现行WHO诊断标准。这些问题带来的思考是：PT的发病率可能并非如报道的那样低，目前关于PT的病理诊断标准可能未能全面反映PT的肿瘤谱系变化和时空异质性，需要进一步深入理解和探讨。本文结合工作体会和近期发表的研究成果，总结PT的形态学特征、变化谱系以及分子研究进展，以期为病理医师诊断PT提供新的视角参考。

1乳腺PT组织学特征

1.1结构异质性

PT结构的异质性，表现为不同区域其间质和腺体的组织学特征不相同：(1)局限于乳腺小叶内的间质增生；(2)肿瘤性间质成分过度生长，损毁原先存在的FA结构并侵及乳腺实质，致乳腺小叶和脂肪杂乱分布；(3)肿瘤性间质细胞推挤腺体呈分支结构，不规则杂乱分布；(4)有残存的FA。有时这些复杂图像可以共存（图1),在同一肿块内见到FA和PT两种成分。对这种现象的理解，也许可以从PT的起源演化模型研究中得到启发,研究发现PT可能遵循两种不同的发生途径：(1)在MED12突变依赖型通路中，MED12exon2/RARA突变被认为会导致良性纤维上皮病变(FA)的发生；叠加TERT/FLNA/SETD2/MLL2等额外基因改变时，进展为PT;继续叠加TP53/PIK3CA/RB1/EGFR/NF1D等基因突变时，则可能发展为交界性或恶性PT。(2)在非MED12依赖的通路中，通过肿瘤基因或肿瘤抑制基因如TERT和（或）EGFR的获得或丢失，直接导致交界性或恶性PT发生。因此，推测PT结构的异质性也许与肿瘤的发生和演化阶段交叉重叠有关，而FA缺少这些形态学异质性的分子基础。

1.2间质异质性

间质细胞决定PT的肿瘤性质。间质异质性主要包括以下几点：(1)细胞密度，不同PT病例之间或同一病例不同区域的细胞密度差异较大，间质细胞密度不均的纤维上皮性肿瘤一般是PT（图2)。低级别PT的间质细胞密度差别很大，与FA有重叠。间质细胞稀少者，不能排除PT（良性或恶性PT都有可能出现局部或部分间质细胞的稀少）；间质细胞中等丰富者，不能确定；间质细胞高度丰富者，支持PT。因此，细胞丰富程度不一定是确定PT的主要依据，需要综合判断。(2)细胞异型性，不同PT的肿瘤细胞形态学特征不同，低级别PT往往具有克隆性改变，细胞核从染色质淡染、丰满的卵圆形至染色质略深染的梭形不等，胞质通常较丰富。细胞的异型性是评价PT级别的重要参考指标，异型性明显的间质细胞一般是高级别PT。(3)细胞外基质，PT肿瘤细胞外基质主要包括淡蓝色黏液样基质、嗜酸性胶原、中性染色的黏液样物质等，不同肿瘤区域有分布差异。如果在同一个纤维上皮性肿瘤内见到不同类型细胞外基质混合，则倾向于PT。(4)核分裂象，核分裂象不是确诊PT的依据，FA中靠近上皮的区域也常见到间质细胞的核分裂象，但远离腺体的间质细胞见到核分裂象，更支持PT诊断。PT肿瘤进展的不同阶段、不同区域核分裂象变化较大。(5)肿瘤细胞分化，PT的肿瘤性间质细胞可以分化为多种细胞类型，常见的为成纤维细胞或肌成纤维细胞；还可以呈脂肪瘤样（图3)、软骨、骨和血管分化，这些成分可以从良性到恶性，取决于这些间叶成分的性质，不能看到异源性分化就诊断为恶性PT。(6)间质和腺体的比例，这两种成分的比例在不同区域变化较大，出现明显区域性差异要考虑PT;FA的腺体和间质比例相对恒定，不同区域变化不大。

1.3腺体变化

PT的叶状结构是肿瘤性间质细胞与腺体互动过程中产生的。两者的相互作用还形成了复杂的形态变化，形成类似于管内型、管周型结构或直接浸润破坏终末导管小叶单位(terminal duct lobular unit,TDLU),当肿瘤细胞穿透膨大、扭曲变形的乳腺小叶时，应考虑PT（图4)。PT中的腺体结构差异一般可见如下变化：(1)腺腔扩张，腺上皮增生、管腔扩大并形成囊状，是间质过度生长突入囊腔形成叶状结构的条件之一。(2)结构紊乱，腺管结构增大、不规则分支，区别于FA的细长小管及串珠状外观。(3)腺上皮细胞的变化，PT中的腺上皮一般呈增生或旺炽性增生状态，在交界性或恶性PT中，可能由于肿瘤间的信号交流和刺激，会出现不典型增生或原位癌（图5);FA的腺体一般呈逐步萎缩趋势，很少出现旺炽性增生。

2乳腺PT非经典组织学模式

区分PT与FA的临床意义在于两者的性质和预后不同。经典形态PT与FA鉴别不难，难在对非经典型PT的识别和确认。在一组复发病例回顾性观察中，发现PT存在明显的肿瘤形态异质性和动态变化谱系，提示叶状结构的形成是PT在某一发展阶段的特有形态,缺乏叶状结构同样可以表现出PT的生物学行为。因此，在本中心已发表文章的基础上，本文总结以下几种少见形态学亚型PT,增加病理医师对PT少见模式或早期模式的了解。这些病例在第一次诊断时均未表现出典型叶状结构，大多数病例首次诊断未考虑为PT,随着疾病进展，复发后出现了典型的PT形态学改变，展示了PT的形态学异质性和其谱系演化特点。

2.1FA样型PT（具有FA样特征的PT)

FA样型PT具有与FA高度重叠的形态学特点。低倍镜下，欠丰富的、形态温和的间质细胞加上缺乏可辨识的叶状结构，往往容易做出FA的诊断。通过与无局部复发的FA病例比较，下列线索对FA样型PT诊断有提示意义（图6、7):(1)间质细胞分布欠均匀，疏密不一；(2)当间质细胞的增生局限在导管周围时，上皮间质联合区扩大、淡染；(3)间质细胞形态较幼稚，可见核分裂；(4)邻近TDLU内可见间质细胞不同程度增生；(5)可伴随假血管瘤样间质增生(pseudoangiomatous stromal hyperplasia,PASH)样改变或黏液样变，缺乏渐进性成熟、胶原化；(6)上皮间质联合区内微血管增生明显。根据随访资料统计，FA样型PT被误诊比例最多。有些PT的早期形态学改变与管内型FA、管周型FA、幼年型FA以及复杂型FA非常类似。因此，对于出现异质性改变的FA,需要慎重评估，避免漏诊。

2.2富于腺体型PT（具有丰富腺体的PT)

PT间质成分的占比多于腺上皮成分，且间质细胞的增生会导致TDLU结构模糊不清，甚至消失。但是，有些PT腺管占比不减反增，易被误诊为腺病或腺瘤。该型PT与腺病不同之处还在于：围绕在腺体周围的间质细胞出现明显增生，形成有规律的分布，有时局部可以见到编织状排列；上皮间质联合区有不同程度扩大，不再表现为疏松黏液样的特化性间质特点（图8)。

2.3PASH样型PT（具有PASH样特征的PT)

PASH样PT最显著特点是其增生的间质成分明显产胶原，在胶原化的背景中出现大量血管样裂隙结构，衬覆单层CD34阳性的扁平细胞，腔隙内无红细胞，即所谓PASH。该型PT肿瘤细胞常先出现小叶间间质增生而非小叶内间质的增生，进而间质弥漫增生，提示该型PT的肿瘤细胞也许起源于小叶间间质。随着肿瘤复发次数增多，肿瘤细胞密度增加，细胞异型性以及核分裂象增多，间质过度生长，逐渐形成叶状结构（图9)。对于PASH样亚型PT,大体上呈结节状肿块是区别于典型PASH的要点，但与富于细胞型（束状型）PASH难以区分。

2.4黏液样型PT（具有黏液样特征的PT)

显著淡蓝色黏液样变的背景中分布稀疏的间质细胞，是黏液样型PT的主要特点。常伴随分支的薄壁血管以及绳索样胶原，肿物边缘不规则，黏液样成分渗透至周围正常组织。上皮间质联合区消失，腺体呈裂隙状，肿瘤性间质细胞密度低，排列疏松，有轻度异型性，大部分病例易见核分裂象。复发后，肿瘤性间质细胞明显增多、细胞异型性增加，黏液样变仍然明显（图10)。

2.5上皮样型PT（具有上皮样特征的PT)

上皮样型PT显著特点是肿瘤性间质细胞呈上皮样形态而不是梭形，表现为细胞核圆形、卵圆形，核仁明显，染色质粗，胞质少，异型性明显，核分裂象易见（图11);弥漫分布时，容易误诊为淋巴造血系统肿瘤或小圆细胞肿瘤。另外，上皮假浸润的生长模式也是其重要特点，异型明显的间质细胞弥漫分布，破坏TDLU，使腺管扭曲、拉长、不规则，腺上皮细胞可表现出一定的不典型性，HE染色难以辨认有无完整肌上皮，另肿瘤细胞具有上皮样特点和缺乏典型叶状结构，“浸润性乳腺癌”或“管周间质肉瘤”的考虑往往是第一印象（图12)。该型PT，肿瘤细胞的空间分布特点是有价值的诊断线索，总能观察到上皮样肿瘤细胞围绕腺管生长，反映了上皮－间质相互作用推动肿瘤发生、发展。与其他类型PT相比，上皮样型PT易伴有肉瘤转化，肿瘤更容易在短时间内出现局部复发。因此，即使未见间质过度生长或叶状结构的形成，也不能轻易排除高级别PT的诊断。

综上，从这组复发后具有典型PTs形态特点的病例中可以发现，部分PTs的早期阶段缺乏间质细胞过度增生和叶状结构。因此，在评估纤维上皮性肿瘤的性质时，不宜过度依赖这两项形态指标，应重点关注间质细胞的异型性和细胞丰富程度，这是判断PT良恶性的关键。此外，不同级别的肿瘤在形态上有一定重叠，甚至PT和FA可能处于同一肿瘤中，需要注意判断，尤其是在穿刺活检标本中要仔细寻找诊断PT的线索。

3乳腺PT标志物及分子研究进展

临床工作中，一些生物学标志物也会被用于辅助诊断及肿瘤分级，如CD34、BCL2、β-catenin、p53、Ki67、EGFR、CD10和p16等，但这些免疫组化标志物的结果并不总能准确反映形态学改变，新的标志物一直在探索中。同时，关于PT发生的分子机制也不断有新的研究发现。在以往的基因组研究中，MED12基因突变被认为是PT发生的关键分子事件，在此基础上提出PT发生、发展的两个分子模型，分别是MED12突变型和MED12野生型（前述已提及）。近年，不断发展的分子检测技术从多角度、多维度向我们展示了崭新的PT基因全景图，也为PT诊断及鉴别诊断提供更客观、更实用的诊断依据。与临床转化应用相关性较大的最新研究内容主要包括如下方面：(1)全基因组DNA甲基化，2022年有研究通过甲基化检测工具微阵列分析，发现PT和FA形成不同类别的甲基化数据，并且与乳腺癌不同，FA的甲基化数据更接近正常乳腺组织对照组；该甲基化数据可以区分FA和PT,但无法区分PT的不同级别。近期，Hench等在一组大样本中全面分析甲基化数据时发现，与化生性癌、FA和肉瘤相比，PT具有独特的甲基化表现；恶性PT与非恶性PT相比，甲基化差异最显著的是HSD17B8 CpG岛启动子的高甲基化，后续实验也证实HSD17B8的RNA表达水平在恶性样本的肿瘤细胞中最低。(2)单细胞转录组测序，该技术首次展示了PT的细胞构成及各类型细胞基因表达情况。成纤维细胞，特别是α-SMA阳性的成纤维细胞是PT的主要细胞成分，与PT的复发或转移行为密切相关。在重点分析这一群细胞基因表达状态时，研究人员筛选出与PT恶性进展相关的驱动分子并进行验证，有望成为诊断及治疗的有价值的生物学标志物。例如，Chen等发现，基质细胞标志物CD146的表达水平与α-SMA呈正相关，并随着肿瘤的恶性程度增加而进行性升高，机制研究揭示CD146是通过阻止DCBLD2的降解从而激活PI3K/AKT信号通路，促进PT细胞的恶性进展。本中心通过PT单细胞转录组和空间转录组测序研究发现，COL4A1/2基因在促进肿瘤发生和进展中均起到重要的促进作用，其蛋白指标随PT肿瘤级别增加而过表达。除了肿瘤细胞分群外，炎症细胞群、血管内皮细胞群等在肿瘤发展进程中也有着巨大潜在影响，值得深入研究探讨。(3)蛋白组学分析，2021年印度一研究团队在纤维上皮性肿瘤样本中进行高通量定量蛋白组学研究，结果表明，细胞外基质相关蛋白和上皮－间质转化相关蛋白在交界性以上的PT中过度表达，同时该研究还确定了三个候选生物学标志物，包括MUCL1、HTRA1和VEGDF,分别在FA、交界性PT和恶性PT中特异表达。近期，本研究团队利用微量蛋白定量分析技术在不同级别的PT样本中筛选差异表达蛋白，结果锚定13个具有显著差异性的蛋白分子。经大样本免疫组化验证，其中VCAN的表达差异具有较大的肿瘤分级价值，良性PT、FA和正常乳腺组织的间质细胞均高表达VCAN,并且VCAN的表达水平与肿瘤级别呈显著负相关。(4)基因表达谱分析，一项涉及750个肿瘤相关基因的大panel基因表达谱分析显示，参与基质重塑和转移（如MMP9、SPP1、COL11A1)、血管生成(VEGFA、ITGAV、NFIL3、FDFR1、CCND2)、低氧(ENO1、HK1、CyBB、HK2)、代谢应激（如UBE2C、CDKN2A、FBP1)、细胞增殖（如CENPF、CCNB1)和PI3K-AKT通路（如ITGB3、NRAS)的基因在恶性肿瘤中异常高表达，而在交界性PT、良性PT、细胞性FA和FA中表达较低，良性PT、细胞性FA和FA的整体基因表达谱非常相似。尽管在交界性PT和良性PT之间观察到轻微差异，但在交界性PT和恶性PT之间观察到更高程度的差异。这些结果有助于PT的诊断和进一步分级，为临床提供有用的生物学和病理生理学信息，以弥补现有的组织学诊断局限性。近年，分子病理在肿瘤诊断和分级中发挥着举足轻重的作用，尤其是与临床转归密切相关的分子标志物的发现，逐步加深了对FA与良性PT的区别以及对FA演化为PT的认识。同时，也认识到，目前尚无绝对的分子指标可以精准解决诊断和分级问题，组织形态学仍然是PT诊断和分级的有效标准。相信随着对PT形态学谱系认识的不断提升，PT的诊断率应该会不断提高。

4结语

明确区分PT与FA,是日常工作中诊断乳腺纤维上皮性肿瘤的最大难点，穿刺活检标本对二者的鉴别诊断尤为困难。免疫组化或分子检测可以起到一定辅助作用，然而仔细进行形态学研判仍然是作出正确诊断的前提，在鉴别诊断中尤其要意识到叶状肿瘤并非一定要有“叶状”结构。

虽然低级别PT总体预后较好，但尽可能将其与FA进行明确区分非常必要，毕竟两者的生物学行为不同。鉴于PT的发生机制及其形态学变化的复杂性，需要对其异质性有充分认识和理解，以增加对PT形态学谱系变化的了解。对于形态学非典型的病例，要结合组织结构、间质和腺体等各项指标进行综合判断，力求精准诊断，为患者提供更加准确、有效的诊疗服务。

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