【专家论坛】骨肉瘤新辅助化疗后肿瘤坏死率规范化评估

骨肉瘤行新辅助化疗至今已有50年历史。与单独手术相比，高级别局限性骨肉瘤经新辅助化疗和手术综合性治疗后可将患者无瘤生存率从不足20%提高到60%以上。新辅助化疗后骨肉瘤切除标本组织学评估肿瘤坏死率是骨肉瘤重要预后指标之一，同时也是指导临床治疗方案的选择。国内外的规范和指南要求对骨肉瘤标本肿瘤坏死率进行规范化评估,但这些规范和指南缺乏详细的描述，导致在临床实践中不同病理医师之间评估的肿瘤坏死率结果一致性较差。本文重点介绍了我们在骨肉瘤新辅助化疗后评估肿瘤坏死率的经验和做法，希望有助于促进该项工作的规范化开展。

新辅助化疗后骨肉瘤不同区域的肿瘤坏死率常存在明显差异。一般而言，软组织肿块内的肿瘤坏死率低于髓腔内；肿瘤与正常组织交界处的肿瘤坏死率低于肿瘤中心；骺板侧的肿瘤坏死率低于骨干侧；灰白色质软区域的肿瘤坏死率低于胶冻样质软区域；具有软组织肿块的骨肉瘤的肿瘤坏死率低于局限于骨内骨肉瘤；中轴骨的肿瘤坏死率低于四肢骨。因此，规范化取材是准确评估肿瘤坏死率的前提和基础。通过标本长轴、肿瘤中心的完整肿瘤薄片必须全部取材，需要标识每一组织块的具体解剖位置。简化的取材流程见图1,详细取材规范可参考文献。

骨肿瘤切除标本体积大，一个完整剖面所切取的组织块数量多，为10~50块。详细标识每一组织块在剖面中具体解剖位置非常重要。我们采取包埋盒摄影方法来标识每个组织块的具体位置，此方法具有省时、标识准确、病理信息系统直接保存、随时调阅的优点。具体步骤：包埋盒上连续打印病理编号，按照切取薄片的外形将包埋盒按顺序摆放在带 有刻度的背景板上；脱钙后薄片标本按照从关节面至骨干侧方向、平行于关节面、按相同宽度将薄片切割呈长条状；将长条状组织沿标本长轴（垂直于关节面）切割成大小相等的组织块；将切好的组织块按顺序依次放入包埋盒中；利用病理信息系统的大体摄影功能对包埋盒拍照（图2)。需要注意的是，尽可能保证肿瘤组织块大小相等；髓腔内肿瘤单独取材，尽量不要将两侧骨皮质一同取材，以防止脱钙过度。

新辅助化疗后骨肉瘤切除标本的大体特征描述主要有：(1)肿瘤范围：骨肉瘤多位于长骨干骺端髓腔内，体积小的肿瘤常位于骨的一侧呈偏心性生长（图3A),体积大的肿瘤完全占据干骺端并不同程度累及骺端和骨干（图3B~D),常伴有骨外软组织肿块，软组织肿块常位于骨的一侧，少数环绕大部分甚至整个干骺端（图3B~D);骺板破坏程度不等，与软组织肿块同侧的骺板首先被破坏。(2)质地：肿瘤质地与基质数量、基质钙化程度及混杂正常骨和骨膜新生骨数量相关。同一肿瘤内质地软、砂砾感及坚硬区相互混杂。基质少的富于细胞区呈灰白色，鱼肉样，质地软。基质丰富并钙化时质硬如骨皮质（图3C)。瘤骨或混杂的正常骨组织数量少时则呈砂砾感。一般情况下，软组织肿块内肿瘤细胞丰富，质地较软，有时混杂较多骨膜新生骨而具有砂砾感；髓腔内基质丰富且常混杂正常骨，质地硬（图3B)。(3)颜色：常呈多彩状，灰白、灰红色为主（图3B)。灰白色区域多为肿瘤细胞丰富区或瘤骨丰富区。肿瘤有明显出血时呈灰红色。与黄骨髓混杂或泡沫样组织细胞丰富区呈黄色。软骨肉瘤成分呈灰白色，有光泽，可混杂有灰黄色质硬钙化或骨化区。(4)囊性变：常存在大小不等囊腔，腔内含清亮或血性液体。毛细血管扩张型骨肉瘤完全由大小不等囊腔构成，无明显实性区，暗红色，质地软（图3D)。(5)坏死：富于细胞区明显坏死后常呈灰黄色或胶冻样改变。瘤骨坏死后大体特征常无明显改变。

骨肉瘤新辅助化疗后常出现不同的组织学改变，在评估肿瘤坏死率时需识别瘤床。瘤床由存活肿瘤细胞和不含存活肿瘤细胞的坏死区域的镜下边界确定。骨外软组织肿块为瘤床的一部分。如果同时存在骨内跳跃转移灶或肺转移灶，两者不纳入瘤床，需单独评估。骨肉瘤新辅助化疗后的组织学改变如下。

3.1存活肿瘤细胞

存在于瘤骨内或瘤骨间，从密集分布至稀疏散在分布。存活肿瘤细胞常出现不同程度的退变。明显退变肿瘤细胞归入存活肿瘤细胞，其形态学特征包括：稀疏散在分布，体积巨大，形态不规则，胞界清楚或不清楚；胞质丰富，淡染，胞质内常见空泡和嗜酸性小球；细胞核具有明显不典型性，多核或分叶核易见，有时核内存在巨大包涵体，染色质被挤压位于核膜下（图4A)。

3.2凝固性坏死

即肿瘤坏死，呈片状分布，肿瘤细胞轮廓尚存，细胞核消失，胞质均质红染，呈嗜酸性（图4B)。需注意脱钙过度可导致存活肿瘤细胞由于失染色而呈嗜酸性改变，不可误判为凝固性坏死。正常软组织或骨组织内细胞可作为脱钙是否过度的内对照。

3.3瘤骨坏死

瘤骨内肿瘤细胞坏死呈嗜酸性变或肿瘤细胞完全消失呈空泡状，坏死肿瘤细胞周围包绕钙化或未钙化的骨样基质（图4C)。瘤骨与富于肿瘤细胞区域常交替存在，富于肿瘤细胞区域先于瘤骨坏死。瘤骨坏死后，外周被单层骨母细胞包绕；骨母细胞在瘤骨周围分泌骨样基质，破骨细胞破坏并吸收瘤骨，最终瘤骨消失代之以板层骨。瘤骨外周骨母细胞围绕时无论瘤骨内细胞是否坏死均归入瘤骨坏死（图4D)。

3.4泡沫样组织细胞

泡沫样组织细胞呈密集灶片状分布或稀疏散在分布于水肿的黏液样间质内。组织细胞大小形态较一致，胞质丰富、淡染，细胞核圆形或卵圆形，核仁不明显。不存在胆固醇结晶，无明显炎症细胞浸润。

3.5黏液样变性

间质高度水肿、淡蓝染，可见少量新生小血管和疏松的纤维母细胞或肌纤维母细胞；该区域肿瘤细胞大多完全消失，有时残存少量明显退变的肿瘤细胞。与大体标本中胶冻样区域相对应（图4E)。

3.6胶原化

胶原纤维增生明显，均质红染，混杂有少量小血管和纤维母细胞或肌纤维母细胞，偶尔存在少量肿瘤细胞（图4F)。

3.7新生编织骨

常存在于瘤床外周硬化性间质内，编织骨外周被单层排列的骨母细胞围绕。旺炽性增生的骨母细胞体积大，核仁明显，核分裂象可见，需与肿瘤细胞相鉴别。

3.8其他改变

肿瘤内有时血管高度扩张充血伴明显出血，含铁血黄素沉着；常见大小不等的囊腔。

肿瘤坏死率指显微镜下观察所有坏死肿瘤组织面积的总和除以肿瘤组织的总面积所获得的百分比。肿瘤坏死率≥90%时为显著病理反应(major pathological response,MPR),无存活肿瘤细胞时为完全病理反应(complete pathological response,CPR)。

肿瘤组织的总面积由两部分构成，包括：(1)存活肿瘤细胞区域：包括存活肿瘤细胞和存活肿瘤细胞所产生的周围基质所占的区域。(2)坏死肿瘤细胞区域：包括凝固性坏死区域、瘤骨坏死区域、泡沫样组织细胞区域、黏液样变区域、胶原化区域和新生编织骨区域；坏死肿瘤细胞及其周围基质计入坏死肿瘤细胞区域。肿瘤自发性坏死、活检特别是切开活检导致肿瘤坏死及骨折引起肿瘤坏死与化疗所致肿瘤坏死难以准确区分，均归入坏死肿瘤细胞区域进行评估。另外，计算肿瘤组织面积时需要注意排除的区域，包括瘤床内囊腔、不含肿瘤的出血灶、正常骨组织及骨髓组织（图5)。

薄片内的每个肿瘤组织块作为基本评价单位。不同组织块之间的肿瘤面积大小存在一定差异，特别是肿瘤和正常组织交界处的组织块与完全为肿瘤的组织块之间差异更加明显。不能简单地将所有组织块的肿瘤坏死率相加总和除以组织块数量所获平均数计为该肿瘤的肿瘤坏死率。这种计算方式可能会由于不同组织块之间肿瘤面积大小存在明显差异而导致结果存在明显偏差。我们采取镜下观察并计算每个肿瘤组织块内存活肿瘤区域视野数和坏死肿瘤区域视野数（必须减掉排除区域的视野数），然后计算所有肿瘤组织块的存活肿瘤区域视野数和坏死肿瘤区域视野数，最终按照存活肿瘤区域视野数除以存活肿瘤区域视野数与坏死肿瘤区域视野数之和，再乘以百分之百即为肿瘤坏死率。建议评估时将每个组织块的存活肿瘤区域视野数与坏死肿瘤区域视野数录入Excel表格中，便于计算和存档。

存活肿瘤细胞有时需与增生的纤维母细胞、骨母细胞相鉴别（图6A、B),免疫组化检测胰岛素样生长因子Ⅱ信使RNA结合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA-binding protein3,IMP3)有助于鉴别诊断。坏死肿瘤细胞、纤维母细胞和骨母细胞中IMP3均呈阴性（图6C),在存活肿瘤细胞中呈弥漫强阳性，明显退变肿瘤细胞表达强度常有所降低（图6D)。

自20世纪70年代陆续提出多个骨肉瘤新辅助化疗反应病理分级系统,其中应用较广的是Huvos分级系统（表1)。第五版WHO骨肿瘤分类、美国病理学家协会(College of American Pathologist,CAP)、欧洲肿瘤内科学会(European Societyfor Medical Oncology,ESMO)、国际癌症报告合作组织(International Collaboration on Cancer Reporting,ICCR)和美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Net-work,NCCN)均推荐采用<10%的可见肿瘤细胞（或≥90%肿瘤坏死）作为临界值应用于表明好的治疗反应。我们建议在病理报告中直接报告肿瘤坏死率的数值。肿瘤坏死率0~90%时以10%增量法记录，＞90%时记录具体数值。

骨肉瘤新辅助化疗后肿瘤坏死率的规范化评估对于患者预后评估和指导临床治疗方案的选择具有重要的意义，且能够提高评估肿瘤坏死率的准确性和一致性。本文对如何规范化评估骨肉瘤新辅助化疗后的肿瘤坏死率进行了详细介绍，供国内同行参考。

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