【讲座】子宫内膜癌错配修复蛋白与微卫星状态检测结果不一致性原因分析

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)发病率位居全球女性恶性肿瘤第六位，2020年新增病例高达41.7万例，伴随9.7万例死亡。其中亚洲地区尤为显著，而国内病例占亚洲病例的近半数。这一疾病的早期诊断对预后至关重要，早期发现者的5年生存率可超过95%,但一旦病情发展至区域扩散或远处转移，生存率则急剧下降至68%及17%,这凸显了早期干预的重要性。

近年来，EC的分子分型研究取得了突破性进展，为预后评估与个性化治疗策略的制定提供了坚实的科学依据。癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)于2013年提出的四分类法,即DNA聚合酶ε(DNA polymerase epsilon,POLE)超突变型、微卫星高度不稳定型(micorsatellite instability-high,MSI-H)、低拷贝数型及高拷贝数与TP53突变型，为理解EC的生物学特性开辟了新视角。随后，WHO(2020)的分类进一步精炼，将EC划分为POLE突变型、错配修复蛋白缺陷型(mismatch repair-deficient,MMRd)、无特定分子特征型(no specific molecular profile,NSMP)及p53突变型,其中MMRd型与TCGA的MSI-H型相呼应，强调了分子特征在疾病分类中的核心地位。随着2023版FIGO分期的更新,分子分型被正式纳入EC的诊断框架中，彰显了整合传统组织病理学与分子分型信息对于优化治疗方案、精准预测预后的不可替代价值。值得注意的是，错配修复(mismatch repair,MMR)/微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)状态的检测在EC管理中占据举足轻重的地位，不仅关乎免疫治疗的有效性预测，也是Lynch综合征筛查的关键指标,因此，国际妇科病理学家协会及中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会均强烈建议对所有EC患者进行相关检测。然而，临床实践中约10%的子宫内膜癌病例在MMR与MSI检测结果上出现了不一致，这一现象无疑给诊疗决策带来了挑战。本文旨在深入探讨这一不一致性的潜在原因，通过剖析背后的分子机制，力求减少误判，为临床提供更准确、更可靠的指导，从而推动EC诊疗水平的整体提升。

MMR机制是生物体内一种极为保守且至关重要的DNA维护途径，其核心在于精确纠正DNA复制过程中可能引入的单个碱基错配、插入或缺失错误，从而确保遗传信息的完整性与稳定性。MMR系统由一系列精密协作的蛋白组成，其中MutS与MutL两大复合物扮演着核心角色。

MutS复合物，被称为“错配识别”蛋白，其成员包括MSH2、MSH3和MSH6等关键蛋白，它们共同协作，以极高的灵敏度识别并绑定至DNA链上的碱基错配及小片段的插入／缺失位点。这一过程是MMR反应启动的关键性第一步。MutL复合物不仅能增强MutS的识别效能，还具备核酸内切酶活性，能精确切割错配附近的DNA链，启动后续的修复过程，以恢复DNA的双链完整性。该复合物的主要成分包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2。其中MLH1、MSH2、MSH6与PMS2是执行MMR功能最为核心的4种蛋白。

在MLH1与PMS2、MSH2与MSH6的配对中，MLH1与MSH2分别作为各自复合物的核心组分，引领并协调整个修复过程。当前，病理学领域广泛采用免疫组化技术来评估这4种关键MMR蛋白在肿瘤细胞中的表达情况，作为评估MMR功能状态的重要手段。

当检测到有一种或多种MMR蛋白的表达出现缺失时，该状态被定义为MMRd,这往往预示着DNA错配修复能力的受损。相反，若4种蛋白均呈现正常表达，则表明MMR功能健全，即错配修复正常(MMR-proficient,MMRp)。值得注意的是，研究已明确表明，MSI,即微卫星不稳定现象的高发往往与MMR蛋白的表达缺失存在直接关联，因此，通过检测MMR蛋白的表达水平，可以间接且有效地推断MSI的状态，为临床诊疗提供有价值的参考信息。

微卫星是指散布在整个基因组中以少数几个核苷酸(1~6个碱基对），为单位重复串联的DNA序列，约占人类基因组的3%。由于微卫星的重复结构，容易发生复制错误，正常情况下由DNA错配修复系统修复。MMR蛋白通过修复DNA复制产生的错配来维持基因组的稳定性，这种错配可能导致微卫星DNA的长度发生变化，称为MSI,并同时增加肿瘤的易感性。目前，对MSI状态进行检测的常用方法是荧光PCR-毛细管电泳法和高通量基因测序(NGS),其中荧光PCR-毛细管电泳法被公认为是MSI检测的金标准。它通过检测肿瘤组织和配对的正常组织或外周全血中微卫星位点，比对肿瘤样本中微卫星不稳定位点数量来判断肿瘤样本的MSI状态。目前为大家所熟知的MSI-PCR检测包括“2B3D”检测套餐、Promega法以及6个单核苷酸检测法。“2B3D”包括2个单核苷酸位点(BAT-26,BAT-25)和3个双核苷酸位点(D5S346,D2S123,D17S250)的5个检测位点。Promega法包括检测5个单核苷酸微卫星位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27)以及2个用于质控的五核苷酸位点(PentaC和PentaD)。6个单核苷酸检测法检测位点包括NR-21、BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24、Mono27。当有2个或2个以上的微卫星位点不稳定时判读为MSI-H,1个位点不稳定为微卫星低度不稳定型(microsatellite instability-low,MSI-L),所有位点均稳定即为微卫星稳定型(microsatellite stability,MSS)。

一般而言，MMRd对应MSI-H表型，MMRp表现为MSI-L或MSS。文献报道恶性肿瘤中MMR与MSI检测符合率因瘤种不同而有差异，在子宫内膜癌中检测结果的不一致性较为突出，约占10%。MMR免疫组化与MSI分子检测结果不一致可分为两类，一类是MMRp出现MSI-H,另一类是MMRd伴随MSS或MSI-L,并未出现MSI-H,前者更常见。常见不一致发生的原因总结如下。

3.1肿瘤的异质性

在解释MMR免疫组化时，蛋白表达的缺失最初被定义为肿瘤细胞核完全无着色。但在少数子宫内膜癌病例中会出现MMR蛋白亚克隆丢失，即在肿瘤细胞阳性的背景中出现区域性肿瘤细胞阴性，且阳性与阴性的肿瘤细胞区域分界明显，这种情况不能武断地判定为阳性。美国病理医师学会(College of American Pathologists,CAP)推荐对免疫组化染色缺失区域使用PCR技术检测MSI状态。另外，由于肿瘤组织的异质性，若MMR蛋白免疫组化检测与MSI分子检测采用不同的组织块，可能导致结果不一致。Smithgall等发现有2例子宫内膜样癌患者术前活检标本中免疫组化检测到MLH1和PMS2共缺失，为MMRd,而在手术切除标本中PCR法检测结果为MSS。

3.2MMR蛋白功能异常但抗原活性保留

有研究表明一些MMR蛋白由于基因发生剪接位点和移码突变导致功能异常，从机制上来讲，其可能编码了结构和功能均有缺陷的蛋白，但是抗原活性仍能被相应的抗体免疫组化检测识别，4种MMR蛋白均显示阳性，而MSI-PCR和MSI-NGS检测则显示为MSI-H。

3.3MMR蛋白免疫组化检测不全面

迄今为止，已发现多种人类MMR蛋白，包括hMSH2、hMSH3、hMSH5、hMSH6、hMLHl、hPMS1、hMLH3和hPMS2等,但是目前病理科只检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2这4种核心蛋白是否表达。除这4种蛋白之外的MMR蛋白缺失及功能缺陷也可能会导致MSI-H。例如MSH3突变可以导致MSI-H,但因为MSH3蛋白不被常规检测，无法识别MSH3蛋白缺失或功能缺陷，从而导致MMRd伴随MSI-H的出现。

3.4POLE基因核酸外切酶结构域突变

POLE基因定位于人类12q24.3,编码DNA聚合酶ε的最大催化亚基，该亚基包含催化结构域和核酸外切酶结构域，对DNA复制过程中的校对功能至关重要。当POLE基因的核酸外切酶结构域（第9~14外显子）发生致病性突变时，POLE蛋白在DNA复制过程中无法及时执行错配校正功能，导致肿瘤细胞基因组DNA出现大量复制错误。POLE核酸外切酶结构域致病性突变发生率在EC中占5.6%~12%。少数EC病例发现因POLE外切酶结构域突变造成患者出现MSI-H而MMR蛋白仍保留的情况,考虑可能是POLE外切酶结构域突变导致了MMR基因突变，继而出现MMR蛋白功能缺陷，从而导致MSI-H,但MMR蛋白的功能缺陷并未被常规免疫组化检测识别出来。有研究报道，1例POLE外切酶结构域突变的病例出现了PMS2基因错义突变，但免疫组化结果为MMRp。

3.5MMR蛋白缺失其功能被代偿

MSH2与MSH6或MSH3分别形成MutSα或MutSβ异源二聚体，两者均为在错配识别和修复启动中起关键作用的ATP酶；MLH1与PMS2、PMS1或MLH3分别形成MutLα、MutLβ或MutLγ异源二聚体，具有切除DNA复制过程中错配的碱基的作用。其中，MSH6的功能可以被MSH3代偿，而PMS2的功能可以被PMS1或MLH3代偿。当MSH6和PMS2蛋白因其基因突变造成功能缺陷时，MLH2-MSH3,MLH1-PMS1或MLH1-MLH3复合物则可以对错配的基因进行修复。所以，免疫组化检测到MSH6和（或）PMS2蛋白表达缺失有时并不影响微卫星状态的稳定。

3.6新辅助化疗造成MSH6蛋白染色丢失

Bao等发现，20%的结直肠癌患者在接受新辅助化疗后肿瘤的MSH6蛋白出现不同程度的核染色丢失，一例患者甚至出现完全丢失，而这部分患者在新辅助化疗前MSH6表达正常且治疗前后均为MSS状态。新辅助治疗导致的MSH6蛋白表达缺失不仅见于结直肠癌，也可见于子宫内膜癌。

3.7PCR检测MSI单核苷酸位点不足

既往研究表明单核苷酸重复序列在MSI-PCR检测中敏感度更高。在结直肠癌中发现携带MSH6蛋白缺失的患者在微卫星上更多表现为单核苷酸位点的改变，若使用的PCR检测位点只含双核苷酸以上位点的突变则无法检测到单核苷酸位点的不稳定,同样，EC中，检测单核苷酸位点的MSI可以识别出更多的MSH6蛋白缺失导致的微卫星不稳定。

3.8最小微卫星位移影响微卫星状态的判读

最小微卫星位移是指检测位点核苷酸的缺失或插入导致最小核苷酸移位(1~3个核苷酸重复移位）。与结直肠癌相比，EC的MSI-H状态更多地由最小微卫星位移导致。这种由1~3个核苷酸变化引起的细微变化，容易导致错误地将EC中MSI-H判读为MSS或MSI-L。

此外，不同克隆的抗体染色的敏感性差异（阅片实践中发现同一组织块用不同克隆号的抗体检测，有的表现为肿瘤细胞完全无着色，而有的表现为少数肿瘤细胞核弱着色）、不同克隆MMR蛋白免疫组化一抗与二抗兼容性欠佳、MSI检测的样本肿瘤细胞含量过低（一般要求肿瘤细胞占全部有核细胞的20%及以上）等也会导致MMR免疫组化和MSI分子检测结果的不一致。CAP强烈推荐对于正在考虑免疫检查点抑制剂治疗的EC患者，病理医师应该首先使用免疫组化检测MMR蛋白而不是PCR或NGS检测MSI;当MMR和MSI结果出现不一致时，病理医师应能够解释免疫组化检测出的MMRd,NGS或PCR检测出的MSI-H的阳性结果，使患者有资格接受免疫治疗，同时对于不一致的结果应进行审查，以确保这种不一致不是由于解释错误所引起。

MMR与MSI均是预测肿瘤免疫治疗反应、筛选Lynch综合征及对子宫内膜癌进行分子分型的不可或缺的指标。然而，因检测原理与内在机制的微妙差异，偶在特定子宫内膜癌病例中展现出不一致的检测结果，这要求临床与病理医师在实践中保持高度的警觉与细致。在解读MMR免疫组化检测结果时，不能简单地根据肿瘤细胞核着色的有无判读为阳性或阴性，对于肿瘤细胞表达明显减弱或亚克隆表达缺失的病例应推荐进行MSI分子检测，进一步明确肿瘤的微卫星状态，更好地指导临床实践。