【专家论坛】结直肠癌MMR免疫组化异常表达的解读

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，发病率和病死率呈逐年上升趋势。2022年全国癌症统计数据显示，我国结直肠癌的发病率和病死率分别位居恶性肿瘤的第2位和第5位。病理检查是结直肠癌诊治必不可少的步骤，大多数结直肠癌在形态学上以普通型腺癌为主，诊断时通常无需借助辅助手段，而一些少见特殊类型的结直肠癌，如低分化神经内分泌癌、肉瘤样癌等，常需借助免疫组化标志物协助确诊。同时还有一些特殊的组织学类型，如黏液腺癌、印戒细胞癌、髓样癌、微乳头状腺癌等与转移性腺癌易混淆，需要借助免疫组化标志物来确定来源。随着对结直肠肿瘤的深入探究、靶向治疗和免疫治疗在结直肠癌中的广泛应用等，一些生物学标志物对临床治疗方案的选择以及林奇综合征的筛选具有越来越重要的价值。因此，免疫组化检查在结直肠癌患者的全流程管理中发挥着越来越重要的作用。关于常用生物学标志物，尤其是DNA错配修复(DNA mismatch repair,MMR)蛋白的一些少见表达的解读，病理和临床医师在临床实践中还存在一些困惑，本文试图给予梳理和分析，以提高大家的认识。

1MMR检测的意义

2结直肠癌中少见的MMR异常表达模式

2.1PMS2单独缺失

在MMR中，所有遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)家族的MSH2和MLH1基因编码区的胚系突变高达45%~64%。PMS2是人类错配修复基因中的重要成员，位于7号染色体上。其与MLH1蛋白形成活性蛋白复合物，编码在修复DNA中起重要作用的蛋白质。

PMS2染色的单独缺失是结直肠癌中一种不常见的免疫表型（图1),基于人群队列的结直肠癌免疫组化分析研究表明，肿瘤中PMS2蛋白单独丢失在结直肠癌中发生率仅为0.5%~1.5%。PMS2染色单独缺失的结直肠癌可能比其他微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)的肿瘤表现出较低频率的MSI组织学特征和更具侵袭性的行为。此外，由PMS2突变引起的林奇综合征具有一些不寻常的临床特征，包括较MLH1或MSH2突变者具有更低的结直肠癌终生风险、较MLH1或MSH2突变者具有更低的罹患结肠外肿瘤的风险，这增加了将这些患者与散发性结直肠癌患者鉴别的难度。而且对于PMS2突变携带者的监测指南也略有差异，即从30岁开始进行结直肠监测，而不是25岁。此外，预防性切除女性PMS2突变携带者的子宫和卵巢似乎并不可取。综上，对所有新诊断的结直肠癌中MMR缺陷病例进行普遍筛查是非常必要的。

人们普遍认为，MLH1基因突变导致主体蛋白MLH1自身降解，同时伴随配体蛋白PMS2的继发性降解，相反PMS2突变可能仅出现PMS2的降解，而不会导致配对主体蛋白的降解。因此，MLH1和PMS2的表达缺失通常表明MLH1发生了改变(MLH1启动子区域的体细胞甲基化或MLH1胚系或体细胞突变），而PMS2表达单独缺失通常表明PMS2存在潜在的胚系突变。但并非完全如此，一部分PMS2染色单独缺失是由于MLH1胚系突变产生了无功能的MLH1蛋白，该蛋白不能与PMS2正确结合，而非PMS2胚系突变导致。更为复杂的是，高达30%的PMS2染色单独缺失的病例并未检测到PMS2或MLH1胚系突变，而是由PMS2体细胞的基因失活所引起。

PMS2免疫组化单独缺失机制非常复杂，代表了复杂的分子异质性。因此在PMS2表达单独缺失的情况下，不能排除MLH1异常，如果确定是MLH1启动子超甲基化，可以避免进行不必要的胚系检测。

2.2MSH6单独缺失

MSH6蛋白全称为MutS蛋白同源体6(MutS homolog6)。在MMR中，MSH6与MSH2蛋白结合，形成MutSα复合物，发挥DNA碱基配对错误修复功能。结直肠癌中MSH6蛋白表达单独缺失的频率在1.9%~14.3%之间。不同研究中频率的变化可归因于研究设计的不同、研究的人群以及定义MSH6缺失的标准不同。

MSH2/MSH6形成异源二聚体，因此MSH2和MSH6同时缺失表明MSH2胚系突变，而MSH6单独缺失通常是由MSH6突变所引起。但是有研究发现MSH6单独缺失常表现为异质性模式，这种异质性表现为肿瘤不同区域内染色突然丧失，紧邻着染色保留区域。通过比较不同肿瘤区域的MSI状态和DNA聚合酶突变的测序发现，MSH6免疫组化缺失区域基因型为MSI-H,而且其分子机制是MLH1高度甲基化或MLH1/PMS2基因胚系突变，而非因为MSH6的改变。此外有些病例在MSH6缺失区发现存在POLD1核酸外切酶结构域体细胞突变。推测DNA聚合酶POLE或POLD1的核酸外切酶结构域的突变引起DNA合成过程中的校对受损，从而导致突变率显著增加，MSH6发生继发性体细胞突变。研究结论是，结直肠肿瘤中MSH6的这种异质性染色通常与其他MMR基因（如MLH1或PMS2)或DNA修复基因（如DNA聚合酶）的异常相关，并不表明MSH6基因有胚系突变。因此当观察到MSH6染色异常表达时，应附以评论，说明这种模式通常不表明有基因胚系突变，从而避免对非疑为林奇综合征的患者进行额外的检测以及引起不必要的焦虑。

此外新辅助治疗后切除结直肠癌样本常发生MSH6单独缺失，可表现为MSH6的异质性或克隆性染色缺失，而其中部分患者术前活检MSH6呈弥漫强阳性（即无缺失）。新辅助治疗诱导MSH6免疫组化表达缺失的机制尚不清楚，可能是治疗诱导的突变、表观遗传变化（如DNA甲基化）或细胞周期调节失调引起的。这也从侧面反映了术前活检标本评估肿瘤MMR状态的必要性。

2.3MMR蛋白表达的异质性

肿瘤异质性是指不同的肿瘤细胞可以表现出不同的形态和表型特征，包括细胞形态、基因表达、代谢、增殖和转移潜能。这种现象既可发生于肿瘤之间（肿瘤间异质性），也可发生于肿瘤内部（肿瘤内异质性）。肿瘤内异质性是指肿瘤内的细胞由于分子变化和克隆选择的逐步累积所驱动的癌症发展过程而具有高度多样性，肿瘤间的异质性是指患者体内或不同患者肿瘤间的分子改变。MSI是结直肠癌发生的早期事件，异质性小。2016年Haraldsdottir等研究50例dMMR的原发性结直肠癌与其相应区域淋巴结或转移性肿瘤之间的MMR免疫组化结果完全一致。这表明使用转移组织来识别dMMR肿瘤患者，无论是筛查林奇综合征还是协助选择治疗方法均可行。基于该研究结果，NCCN指南建议对转移性结直肠癌在不可获取原发肿瘤的情况下，可用转移组织进行MMR检测。

在临床实践中，约30%的dMMR结直肠癌患者对免疫检查点抑制剂(ICI)原发耐药，另外，相当一部分患者在初始获益后继发耐药，反映了这类肿瘤确实存在异质性可能，肿瘤异质性是影响ICI疗效的一个关键机制。目前关于MSI或MMR检测瘤内和瘤间异质性及其在肿瘤生长过程中可能的变异方面的数据较少。在有关MMR蛋白表达异质性的研究中，11.9%的结直肠癌患者原发灶和转移灶MMR状态不一致，腹膜和肝转移患者更可能存在MMR状态异质性。原发灶为dMMR而转移灶为错配修复完整(mismatch repair proficiency,pMMR)的可能性相对增高，转移灶MMR状态不一致可能与原发性或获得性ICI耐药有关，因此如果原发灶为dMMR,对转移灶进行再分析可能很有价值。

虽然MMR的瘤内异质性表达是一种罕见现象，但正确识别以防止假阳性或假阴性评估具有重要意义。MMR的异质性表达模式包括腺内型、克隆型和区域型（图2、3),多数情况下同一肿瘤中，不同的异质性表达模式共存，累及的范围也不同。在异质性表达的蛋白中，MSH6和PMS2比例较高，其中MSH6的异质性常表现为克隆性。

对5例存在MMR异质表达病例的异质性表达区域分别进行MSI和NGS检测，发现4例MMR蛋白缺失区均为MSI-H,剩余1例无论是缺失区还是保留区均为微卫星稳定(mic-rosatellite stability,MSS)。异质性表达可能与MLH1启动子的异质性甲基化、异质区域内的DNA含量存在差异有关，也可能与肿瘤分化程度相关。因此，对于肿瘤表现出异质性染色区域不应被视为MMR免疫组化完整／保留或人工误差，尤其是MSH6在肿瘤中经常发生异质性。总之，MMR蛋白的异质性染色模式可能导致结果的错误判读。这也是常规病理实验室只进行免疫组化检测的主要风险，即把局灶性、异质性或弱染色模式错判为pMMR。因此强烈建议使用MSI和MMR蛋白同时检测方案。

3MMR蛋白表达与分子检测不一致问题

MSI多由MMR蛋白表达缺失导致的MMR功能缺陷所致，因此通过检测MMR蛋白缺失可以间接反映MSI状态。但是免疫组化检测MMR蛋白表达与基于DNA分析检测MSI状态是两个不同层面、不同靶点的检测，两者作为评估相关生物学效应的不同检测方法，多数情况下具有高度一致性，但仍有1%~10%患者出现MMR蛋白和MSI检测不一致情况。

最常见的不一致为免疫组化检测MSH6表达缺失，但MSI检测为MSS,其原因是MSH3可以替代MSH6的功能，部分活化MMR系统，从而保留MSS状态。另一种常见情况是MLH1免疫组化表达完整，其实应为假阳性，MLH1错义突变编码无功能蛋白，因此肿瘤为MSI-H。或者由4种基因以外的其他基因引起的MSI,如POLE、POLD。

美国食品药品监督管理局(FDA)批准免疫检查点抑制剂治疗dMMR或MSI-H的晚期实体瘤患者。但是对于检测手段并未做相应推荐，当出现MMR和MSI检测不一致，是否适用免疫治疗？为了解答该问题，美国病理学家学会(CAP)召集了一个专家工作组，包括分子病理学家协会、美国临床肿瘤学会和患者权益组织合作制定了免疫检查点抑制剂治疗中的MMR和MSI检测指南。指南第一条强烈建议，对于正在考虑进行免疫检查点抑制剂治疗的结直肠癌患者，病理学家应使用免疫组化来确定MMR和（或）PCR来确定MSI。虽然这些方法是首选，但已被验证为dMMR的NGS检测也可用于确定MSI状态，以确定免疫检查点抑制剂是否适用于这种癌症类型。在这种情况下，专家小组成员特别强调NGS检测“必须针对MMR免疫组化或PCR的MSI进行验证，并且必须显示出等效性”。但是对于子宫内膜癌患者，应使用免疫组化来确定MMR,而非使用PCR或NGS来确定MSI。该指南强调了除结直肠癌之外，还没有证据支持使用广泛的NGS测试来检测微卫星状态的立场，即这些检测方法并非可以互换。

当出现不同检测方法之间结果不一致时，CAP建议首先应对不一致结果进行审查，以确保不一致结果不是判读错误所导致。如果采用的任何方法产生不确定的结果，病理学家应该采用替代技术或在不同的肿瘤块上重复相同的技术。实验室应该对不确定的病例有一个强有力的同行评审程序。同时建议如果MMR免疫组化出现克隆性缺失，病理学家应该通过PCR专门对MMR蛋白免疫组化表现异质性的区域进行显微切割后行MSI检测。最后CAP建议如果出现不一致的结果，病理学家应该将免疫组化证实的dMMR或NGS/PCR证实的MSI-H均解释为阳性结果，从而使患者有机会接受免疫治疗。

总之，MMR蛋白检测是筛查林奇综合征以及预测肿瘤免疫治疗疗效的关键生物学标志物，病理医师要重视并加强相关培训，提高判读的准确性和重复性，而且不同缺失模式背后的分子机制往往非常复杂，加强临床与病理医师的沟通合作可能更有益于真实世界的探索。肿瘤异质性的存在使免疫组化检测MMR和分子检测MSI必然存在不一致性，在实际临床中，MMR和MSI联合筛查可能提高阳性检出率，以便让更多患者获得更大的临床效益。

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