NRR文章分享：中科院动物所胡宝洋、王昱凯团队提出一种“现货型”神经细胞微球制剂的一站式制备方案

中科院动物所胡宝洋、王昱凯团队

在脊髓神经发生过程中，顶板的骨形态发生蛋白（BMP）的背侧分泌作用于脊髓祖细胞，以维持和调节神经管中的干细胞池。BMP途径中的信号传导始于BMP-2，4，6或7配体与II型受体（BMPRII）的结合，导致BMP I型受体的募集和磷酸化。激活的BMPRI磷酸化特定的Smads（一个转录调节因子家族），介导BMP的下游信号效应，包括神经管背中央模式期间的细胞命运。

白血病抑制因子（LIF）是另一种高度多效性信号肽，属于白介素-6细胞因子家族。所有家族成员都激活信号转导子和转录激活子3（STAT3），这是一种影响神经干细胞增殖、谱系和迁移的转录因子。与它的同源受体LIF受体/CD118结合，招募另一种受体糖蛋白130（gp130）形成异二聚体。二聚化后，受体招募并激活Janine激酶（JAK）家族成员，进而磷酸化STAT并二聚化，然后转移到靶基因受转录调控的细胞核。

BMPRII和LIF暴露的影响往往是细微差别的，不一定适合体内实验。例如，BMP受体的预先激活对LIF反应性至关重要，并通过下游形成由p300桥接的STAT3-Smad1复合物来与LIF协同作用，以诱导GFAP表达。澳大利亚悉尼大学Tailoi Chan-Ling先前对人类脊髓神经前体培养物的体外研究表明，LIF和外源性BMP4协同促进星形胶质细胞谱系发育。在发育的大鼠前脑中，LIF通过JAK/STAT途径作用于桡神经胶质细胞，以促进对神经胶质谱系的作用，而BMP2信号下调相同的神经胶质限制性前体抗原A2B5/4D4，并促进神经元限制性前前体标记物的表达。因此，BMP/LIF对分化的影响可能是前体细胞类型和CNS区域依赖性的。

迄今为止，大多数研究BMPRII在神经系统发育中的作用的研究都使用了小鼠和大鼠模型，并且有充分证据表明，源自小鼠和人类模型的神经干细胞之间存在显著差异。除了中枢神经系统结构的广泛神经解剖学差异外，如果没有进一步的研究，这些发现也不能被认为适用于人类脊髓发育的研究。

澳大利亚悉尼大学Tailoi Chan-Ling的研究团队在发表于《中国神经再生研究（英文版）》2024年第2期的研究通过器官型神经球的形成，更准确地反映体外早期人类神经发育过程。其假设LIF治疗可以改变神经球的细胞结构，这是由于其已知的促迁移效应和与BMP配体和受体的协同信号传导。目前，尚未见描述BMPRII在发育中的人类胎儿脊髓中定位的研究。

Tailoi Chan-Ling等的研究首次在人类胎儿脊髓中分离出BMPRII+NPCs，并对其进行了定性。结果显示，LIF与高密度再聚集培养物协同作用，支持神经球的器官型重组，由表面BMPRII+ NPCs表征。实验提供的体外模型能够扩增10代以上的人类胎儿脊髓细胞数量。BMPRII在脊髓发育中的作用的研究主要依赖于小鼠和大鼠模型，通过推断得出人类发育的特性。实验中的体外模型为更好地理解神经发育途径提供了一种新的工具，包括BMP信号，以及脊髓损伤研究和药物治疗测试。

图1 与中脑多巴胺神经前体细胞相匹配的小孔径明胶微载体（图源：Feng et al., Neural Regen Res, 2024）

为优化细胞的三维分化条件，利用摇瓶生物反应器比较了不同的搅拌模式、接种时间点、接种密度等工艺参数（图2）。首先使用二维条件下未产生神经纤维（分化第11和17天）的细胞进行微载体接种和分化培养。分化到第25天时，第11天接种的细胞可见明显的聚团现象，且细胞存活率和分化效率均低于第17天接种的细胞。因此，在后续的三维分化中，选择了接种第17天的中脑多巴胺神经前体细胞至小孔径明胶微载体上。另外，在2种不同搅拌模式（恒定模式：搅拌速度持续保持为60 r/min；延迟模式：静止24h后以60 r/min开始搅拌）下进行了细胞接种，发现恒定模式下细胞的贴壁率明显低于延迟模式，说明接种后24h内设置静止时间可促进细胞黏附。进一步对细胞接种密度进行了探索，发现3-7×105个细胞/mg微载体的接种密度可实现中脑多巴胺神经前体细胞的高效分化，其中5×105密度分化的TH+、TUJ1+的细胞比例最高。通过以上分化工艺的优化，初步建立了基于小孔径明胶微载体的中脑多巴胺神经前体细胞分化体系，通过多个批次的验证确定了该体系的稳定性。

图2 中脑多巴胺神经前体细胞与小孔径明胶微载体结合分化工艺的筛选（图源：Feng et al., Neural Regen Res, 2024）

细胞的长期稳定保存是获得“现货型”细胞产品的重要基础，可使细胞在使用前接受充足的质量检测[6]。通过8种冷冻保存试剂对分化获得的中脑多巴胺神经前体细胞微球进行冻存和复苏，检测细胞存活率，以筛选可用的冻存试剂（图3）。液氮保存4周后，使用CS10和D10冻存的细胞的处理最高，分别达到86.9 ± 1.4%（CS10） 和83.4 ± 0.7%（D10），且细胞主要标志物的表达没有发生明显变化。与单细胞悬液相比，中脑多巴胺神经前体细胞微球的冻存不受细胞密度的影响，且能较好的维持神经细胞轴突的完整性。且这2种冻存试剂均不含血清或动物成分，符合cGMP生产要求，这极大地支持了该细胞产品的应用。

图3 中脑多巴胺神经前体细胞微球冻存体系的建立（图源：Feng et al., Neural Regen Res, 2024）

为评估中脑多巴胺神经前体细胞微球移植后的存活情况，将分化至25d的中脑多巴胺神经前体细胞悬液和中脑多巴胺神经前体细胞微球分别移植到免疫缺陷小鼠大脑纹状体中，3个月后通过脑切片染色比较2种制剂形式的体内表现（图4）。结果显示2组动物中存在存活的移植物，且中脑多巴胺神经前体细胞微球组细胞存活数量显著高于细胞悬液组，并且细胞没有过度生长。此外，与细胞悬液组相比，中脑多巴胺神经前体细胞微球组移植物中可见更多的FOXA2和TH双阳性多巴胺能神经元。免疫组化结果显示，中脑多巴胺神经前体细胞微球移植物周围的Iba1+小胶质细胞、GFAP+星形胶质细胞和CD3+ T细胞的数量均少于细胞悬液组，说明使用小孔径明胶微载体可减少移植部位炎症反应，有助于降低脑内移植物诱导的免疫排斥。

图4 中脑多巴胺神经前体细胞微球体内移植显示出较高的细胞存活率和较低的免疫排斥反应（图源：Feng et al., Neural Regen Res, 2024）

综上所述，基于微载体的神经细胞三维分化体系，能够（1）支持细胞的分化、成熟，并用于生产即用型中脑多巴胺神经前体细胞产品；（2）减少细胞收获带来的机械损伤并维持神经元轴突的完整性；（3）支持液氮冻存及复苏；（4）提高中脑多巴胺神经前体细胞移植物的存活，并降低移植区域的免疫反应。该研究结果将为神经类细胞制剂的开发和应用提供基础。

但是这一实验没有关注生物材料在脑内的降解和残留，将来应考虑使用带有标记的载体来进行移植和体内观察。另外，该研究只评价了中脑多巴胺神经前体细胞微球移植后的存活情况，并没有进行细胞有效性的探究。接下来，需要利用帕金森病动物模型来检测中脑多巴胺神经前体细胞微球移植对疾病的治疗效果，以进一步评估该细胞制剂用于细胞替代疗法的治疗潜力。

作者介绍

第一作者：冯琳，中科院动物所博士。

第一作者：李达，中科院动物所工程师。

通讯作者：胡宝洋，中科院动物所研究员。

通讯作者：王昱凯，中科院动物所副研究员。

该团队主要从事干细胞与再生医学领域研究，重点关注多能干细胞向神经谱系的分化机制、人类神经发育和细胞分化的独特性以及干细胞医药学应用的系统化评估等科学问题。

此项研究得到国家重点研发计划、国家自然基金、中国科学院稳定支持基础研究领域青年团队计划、北京市科技重大专项的支持。

文章在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2024年2期发表。

引用本文：Lin Feng, Da Li, Yao Tian, Chengshun Zhao, Yun Sun, Xiaolong Kou, Jun Wu, Liu Wang, Qi Gu, Wei Li, Jie Hao, Baoyang Hu, Yukai Wang. One-step cell biomanufacturing platform: porous gelatin microcarrier beads promote human embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic progenitor cell differentiation in vitro and survival after transplantation in vivo[J]. Neural Regeneration Research, 2024, 19(2): 458-464.