20世纪著名的“反应停”事件引起人们对外消旋体药物弊端的关注，异构体的控制逐渐成为手性药物杂质控制的关键点之一。随着化学合成及分析技术的发展，大多数制药公司和研究机构在确定手性候选药物时，呈现倾向于开发单一对映体的趋势。在临床常用的药物中超过50%的上市药物具有一个或一个以上手性中心，使得手性分离分析技术研究与发展是十分必要的。色谱法是当前最可靠和最常用的测定化合物手性的方法，包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳和二维液相色谱等。
二维液相色谱是传统液相色谱技术的重要补充。二维液相色谱是在第一维(1D)色谱柱上进行等度或梯度洗脱分离后，1D 色谱柱中的流出物进入第二维(2D)色谱柱。要使2D色谱柱对样品的总体色谱分离效果产生实际影响，则该色谱柱必须具有与1D色谱柱截然不同的分离选择性，使得1D色谱柱上完全或部分叠加的相邻色谱峰在2D色谱柱上得到分离的可能性大大增加。2D与1D的分离能力不是简单加和，而是乘积关系，使得二维分离能力得到了极大的提高。
研发团队的绝大部分产品有手性IPC检测的需求。在合成路线初筛阶段，不仅需要检测中控反应液的转化率，还需鉴定产物的手性纯度。如果将反应转化率和手性纯度鉴定分别在两个一维液相色谱上进行，会消耗大量的检测时间，且中控反应液体系复杂，常含有水和多种有机溶剂，对手性色谱柱的固定相和填料之间产生破坏，手性纯度鉴定前需要经过复杂、冗长的前处理过程。因此亟待开发一种新的手性检测方法，可以直接将反应液进行正相检测，实现在一个二维液相分析方法中同时检测化合物的转化率和手性纯度，节省检测时间，降低检测成本。本文主要展示酶化学产品在二维液相色谱仪上成功分析的案例，首先在一维色谱柱上进行中控反应液转化率的测定，然后切取一维目标色谱峰进入二维色谱柱对手性产品进行手性纯度测定。
案例分享
（1）反应路线如图1，原料（SM）通过一系列的反应，得到一个手性中心的产品（TM），在这个反应过程中需要检测SM到TM的转化率，同时检测TM的手性纯度。
图1. 反应路线图
（2）1D色谱条件：选用Hilic色谱柱。Hilic是一种使用极性固定相用于改善极性物质的保留和分离选择性的色谱柱，与正相色谱相似。流速：1mL/min，流动相：Hexane/EtOH 体系。
2D色谱条件：选用OD-H色谱柱，OD-H为多糖衍生物正相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯），是使用最广范的一种手性填料，具有优秀的分离能力和耐受性。流速：1mL/min，流动相：Hexane/EtOH体系。
经过处理的中控溶液首先进入1D色谱柱中进行SM和TM的分离，通过检测器进行转化率测定（图2a）。然后把所需目标峰（TM）切入定量环，将定量环中的样品随流动相流入2D色谱柱中进行产品（TM）及产品的对映异构体（TM-enantiomer）的分离，再流入检测器进行检测（图2b）。
图2. 二维液相色谱分离与检测系统
（3）二维液相检测结果如图3所示，10 min前为1D色谱图，表明：SM和TM分离度良好，可以用于计算SM到TM的转化率。10min后为2D色谱图，可用于计算TM的手性纯度。实现了一张谱图上可以同时体现转化率和手性纯度的目的。
图3. 二维检测色谱图
总结
二维液相在分离复杂体系上展示了非凡的能力，在两个维度展开复杂体系样品分析，可以显著提高分离能力，改善目标化合物色谱峰检测可靠性，同时大大缩短分析工作时间。当杂质或对映异构体与目标峰的分离度不够，甚至是完全重合时，也可考虑使用二维液相进行二次分离，以达到检测目的。随着色谱联用技术的不断发展，二维液相必将在分析、制药及临床等领域展现更广泛的应用前景。
参考文献
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