温故知新｜宫内脂多糖暴露后新生大鼠脑髓鞘基质蛋白、胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的表达变化
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2024-07-03 17:01
北京
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引用格式：戴红梅,肖彩菊,余肖,等. 宫内脂多糖暴露后新生大鼠脑髓鞘基质蛋白、胶质纤维酸性蛋白、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的表达变化[J]. 中华围产医学杂志,2010,13(01)：41-45. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2010.01.012
基金项目:国家重点基础研究发展计划 973 项目 (2005CB522507);国 家 “十 一 五 ”科技支撑计划项目 (2006BAI05A07) 作者单位:430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科[戴红梅(现在中南大学湘雅三医院儿科)、肖彩菊、余肖、王伟、应艳琴、宁琴、罗小平] 通信作者:罗小平,Email:xpluo@tjh.tjmu.edu.cn 【摘 要】
目的 探讨宫内脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)暴露后新生大鼠脑中炎症因子的表达与 脑白质损伤的关系。
方法 向孕19dSD大鼠宫内注射LPS(0.4μg/孕囊间)构建宫内感染大鼠模型 作为 LPS组(n=14),对照组给予同体积的无菌生理盐水(n=10)。取1、3、7、11日龄新生大鼠脑标本 (每组每时间点6只),通过免疫组织化学方法检测髓鞘基质蛋白与胶质纤维酸性蛋白在新生大鼠脑组织中的表达;采用逆转录-聚合酶链反应技术检测脑组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-αmRNA 的水平。组间差异比较采用t检验。
结果 (1)LPS组孕鼠胎盘组织 HE染色可见显著炎性细胞浸润、间 质明显增生、毛细血管腔变窄。(2)LPS组11日龄新生大鼠小脑、间 脑髓鞘基质蛋白表达分别 为 1.29±0.76和1.71±0.49,均较对照组(分别为2.43±0.79和2.50±0.76)明显减少(P 均<0.05);而 LPS组11日龄新生大鼠海马、胼胝体、间脑和小脑中胶质纤维酸性蛋白的表达分别为2.71±0.49、 2.40±0.55、1.50±0.55和2.80±0.45,均较对照组(分别为1.75±0.50、1.50±0.58、1.00±0.00和 1.60±0.55)增强(P 均<0.05)。(3)LPS组与对照组1、3、7、11日龄新生大鼠脑组织中白细胞介素-1 与肿瘤坏死因子-αmRNA的表达差异无统计学意义(P 均>0.05)。
结论 宫内 LPS暴露导致宫内 β 炎性改变、影响胎盘血供,并致新生大鼠低出生体重,可能引起新生大鼠出现以低髓鞘化及反应性星形胶质化为特征的脑白质损伤。
【关键词】妊娠并发症,感染性;脂多糖类;动物,新生
脑白质损伤 (white matter damage,WMD)主要表现为特异性星形胶质细胞增殖、肥大及胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein,GFAP) 表达增多导致的反应性星形胶质化和髓鞘基质蛋白 (myelin basic protein,MBP)表达减少或缺乏导致 的髓鞘化减低。研究证实宫内感染诱发的胎儿非特异性炎症反应与自发性早产及新生儿 WMD 的发生密切相关,且宫内感染或孕母全身性感染后均能 在胎儿血液循环以及脑组织中发现促炎性与抑炎性的细胞因子、α与β趋化因子以及凋亡相关因子的 表达明显上调[1-6],并可导致脑室下及脑室周围纹状体、侧脑室生发基质区内细胞死亡增多,出现典型的反应性星形胶质化及髓鞘化减低[3-4,7-10]。但生后炎症因子水平对 WMD 的预测价值尚不明确。本研究通过检测新生大鼠脑中 MBP、GFAP及炎症因子白细 胞 介 素-1β(interleukin-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α)的表达,探讨宫内感染与新生大鼠脑组织炎症反应及与 WMD之间的关系。健康成年SD雌鼠24只,雄鼠6只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。雌雄大鼠每晚按 4∶1合笼，次晨若雌鼠阴道分泌物镜检见精子记为妊娠第1天。孕鼠按随机数字表法随机分为脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)组(n=14)与对照组(n=10)。在孕19d(足孕期为22.5d)时取各组孕鼠予1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,通过剖宫手术向 LPS组孕鼠每两个孕囊间的宫腔注入10μlLPS(O55:B5,L4524,40μg/ ml,美国Sigma公司),对照组给予同体积的无菌生理盐水。饲养至分娩。对照组获新生大鼠60只,均存 活;LPS组获新生大鼠40只,30只存活。 1.孕鼠胎盘取材及病理分析:随机留取 LPS组与对照组胎盘组织,通过 HE 染色观察胎盘组织病理改变。 2.脑组织取材:取 LPS组和对照组1、3、7、11 日龄新生大鼠各 6 只,称重后以 1% 戊 巴 比 妥 钠 0.1~0.2ml腹腔麻醉后断头取脑,以无菌刀片沿矢状缝切开,一半脑组织置于4%多聚甲醛中固定,于 24h后进一步透明、包埋、切片;另一半脑组织迅速 置于液氮中,次日转至-70 ℃冰箱保存。 3.新生大鼠脑组织中 GFAP与 MBP的表达: 采用免疫组织化学方法,步 骤参照 SABC 试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司)说明书进行。其中 GFAP与 MBP 一 抗 (均为多克隆兔抗)滴度均为 1∶150(阴性对照用 PBS替代),DAB 显色,苏木素复染。结果判断标准为:胞浆(轴索)呈现棕黄色颗粒为阳性。各组标本于不同部位(胼胝体、海马、间脑、小脑)固定放大倍数(×200)与固定亮度照相,根 据阳性染色的强度及形态分布分为4个评分等级: 无任何阳性表达为0分;<25%细胞阳性,阳性细胞 胞体小,突起短,着色浅为1分;25%~50%细胞阳 性,阳性细胞胞体稍增大,突起稍增粗增长,着色中 偏深为2分;>50%细胞阳性,阳性细胞胞体显著增 大,突起显著增粗增长,着色深为3分。 4.检测新生大鼠脑组织中IL-1β、TNF-αmRNA 的表达:采用逆转录-聚 合酶链反应技术 (reverse transcript-polymerase chain reaction,RT-PCR):cDNA 合成及 PCR 反应均参照说明书(RevertAidfirst strandcDNASynthesisKit,由 Fermentas公司提供) 进行,内参照β-actin及细胞因子TNF-α、IL-1β引物序列(北京奥科生物技术公司合成)β-actin(内参照)引物:上游5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′;下游3′-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-5′,产物大小466 bp;TNF-α引物:上游5′-GCGTGTTCATCC-GTTCT- 3′;下游 3′-CCACTACTTCAGCATCTCGT-5′,产 物 大 小200bp;IL-1β 引物:上游5′-AAGGAGAGAC AAGCAACGA-3′; 下游3′-CCCATACACACGGACAACT-5′,产物大小 614bp。PCR 反 应 条 件: 94 ℃预变性5min,94℃变性45s,55℃退火40s, 72 ℃延伸45s,32个循环,72 ℃终末延伸10min。取8μlPCR 反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,通过 UVP凝胶成像系统分别测定目的基因与内参照 β-actinPCR产物条带的吸光度值,二者比值为目的基因相对表达量。 测定结果用均数 ± 标准差 (x±s)表 示,采 用 SPSS12.0软件进行统计分析,LPS组与对照组组间比较经方差齐性检验后进行t检验,P<0.05为 差异有统计学意义。 两组孕鼠术后均可正常进食、活动。对照组均健康,新生鼠活产率为100%(60/60);LPS组孕鼠死亡、流 产 及 死 产 各 1 只,新生鼠活产率为 75% (30/40)。LPS组孕期为(21.7±0.6)d,较对照组 [(22.3±0.3)d]短(t=2.145,P=0.028)。LPS 组新生大鼠出生体重为(5.38±1.05)g,较对照组 [(5.93±0.33)g]轻(t=2.223,P=0.031)。孕鼠 胎盘组织病理改变情况见图1。 ![]()
两组中3、7日龄新生大鼠才开始在间脑、小脑中有少量 MBP 阳性细胞;11日龄新生大鼠间脑、小脑部位 MBP阳性细胞明显增多,但 LPS组较对 照组表达显著减少、染色浅。见表1、图2。 两组中1和3日龄新生大鼠脑组织中已可见少量 GFAP阳性细胞;7日龄新生大鼠间脑、小脑、胼胝体、海马以及皮层下白质中均可看到较多 GFAP 阳性表达;11日龄新生大鼠脑各部位 GFAP阳性表达明显增多,且 LPS组表达较对照组增加显著。见表2、图3。 三、新生大鼠脑组织中IL-1β与 TNF-αmRNA 的表达1、3、7和11日龄新生大鼠脑中IL-1β、TNF-α mRNA 的表达在 LPS组与对照组之间差异没有统 计学意义。见表3。 ![]()
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目前国内外研究中所用的宫内感染动物模型有多种,据给药途径不同可分为经腹腔、经宫颈、羊膜囊内、宫内等四种不同的方式。经腹腔给药所 需 LPS剂量较大且易导致死胎或死产,甚至孕鼠全身感染或死亡;羊膜囊内注射的大肠杆菌或 LPS可直接作用于胎鼠,与临床宫内感染的模式不大吻合,且 术中可能导致羊水外溢,增加外伤与感染等干扰因素,但较少导致早产;经宫颈或宫内给药所需LPS剂量明显减少,较符合临床实际,易使孕鼠早产但很少导致流产或死产[11]。故本研究采用向孕19d的大鼠孕囊间的宫内注射 LPS来构建宫内感染大鼠模型。 本研究证实 LPS组孕鼠胎盘组织中出现了显著的炎性细胞浸润,在1、3日龄新生大鼠脑组织中已可见少量 GFAP 阳性细胞表达。而在1日龄新生大鼠脑中未发现 MBP阳性表达;3和7日龄新生大鼠间脑、小脑中才开始有少量 MBP 阳性细胞。GFAP是成熟星形胶质细胞的特征性标记物。其活化又称为反应性星形胶质化,是中枢神经系统对各种损伤因子的修复反应,其特征表现为 GFAP大量表达。有研究分别采用 ELISA、免疫组织化学法对正常成年大鼠不同脑区 GFAP 的表达进行分析发现脑干与下丘脑 GFAP 含量最高,其次为小脑、嗅球和海马[12]。研究证实宫内注射 LPS后8日龄新生鼠脑中 GFAP 阳性星形胶质细胞增多、MBP 阳性少突胶质细胞减少以及脑室系统扩大[9-10]。向5日龄新生鼠脑内注入LPS的同时给予IL-1β受体拮抗剂则可明显减轻星形胶质细胞增多症,也可增加 MBP阳性细胞的表达,而直接注入IL-1β或 TNF-α (10ng/只)24~72h后也出现星形胶质化,凋亡细 胞增多,IL-1β还可显著减少发育中的少突胶质细胞数目,并减少 MBP的表达,但 TNF-α在这些方面却没有相应作用[9-11,13]。也有研究表明在 LPS所引发的炎症反应中 Toll样蛋白受体-4是一种关键性炎症因子,LPS可通过其激活循环免疫细胞及小胶质细胞,并使对前体少突胶质细胞具损伤作用的促炎性细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、血管内皮生长因子、IFN-γ、趋 化 分子及活性氧分子等合成增加[14-17]。向大鼠腹腔或子宫内注射不同剂量的 LPS 后 15min至2h内在外周血中即检测到炎症因子的水平持续升高,且与 LPS剂量正相关[3-4]。宫内注射 LPS后24h内可以检测到胎鼠脑中细胞因子IL-1β 与 TNF-α 表 达增加[10]。Rousset等[8]向孕 19~ 20d的大鼠腹腔植入大肠杆菌后在3日龄新生鼠脑 中检测到IL-1β显著升高。Garnier等[18]向3日龄 新生羊静脉内注射 LPS后1~3h检测到炎症反应 达高峰,12~72h后恢复到正常,且部分新生羊脑 室周围白质出现典型的囊性变。而本研究对孕19d 孕鼠宫内注射 LPS后,并未发现新生大鼠脑中炎症因子 TNF-α与IL-1βmRNA 的表达有改变。 ![]()
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