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研究背景
环磷酰胺通过激活雷帕霉素哺乳动物靶标（mTOR）通路来刺激原始卵泡，从而导致原始卵泡的积累，其中大部分会发生凋亡。雷帕霉素是一种mTOR抑制剂，它能调节原始卵泡的活化，并对乳腺癌细胞增殖具有潜在的抑制作用。
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研究目的
在异种移植乳腺癌小鼠模型中，雷帕霉素（一种卵泡激活途径抑制剂和抗肿瘤药物）和环磷酰胺（一种毒性很强的卵巢抗癌药物）同时服用能在多大程度上通过何种机制防止环磷酰胺诱导的卵巢储备功能丧失并抑制肿瘤增殖？
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研究方法
为了评估卵巢滤泡凋亡，在给8周大的小鼠注射乳腺癌细胞3周后，将其随机分为3个治疗组：对照组、环磷酰胺组和环磷酰胺+雷帕霉素组（Cy + Rap）（n = 5或6只小鼠/组）。小鼠接受雷帕霉素或对照药物治疗 1 周，然后接受单剂量环磷酰胺或对照药物治疗。随后，在环磷酰胺给药 24 小时后切除卵巢（短期治疗组）。为了评估卵巢中卵泡的丰度和mTOR通路，以及抗肿瘤作用和对肿瘤中mTOR通路的影响，将8周大的异种移植乳腺癌小鼠随机分为三个治疗组：载体对照组、Cy组和Cy + Rap组（n = 6或7只小鼠/组）。雷帕霉素（5 毫克/千克）或载体每天给药 29 天。环磷酰胺（120 毫克/千克）或载体每周给药三次（长期治疗组）。每周测量肿瘤直径。最后一次环磷酰胺治疗七天后，收获卵巢，固定并切片（用于卵泡计数）或冷冻（用于进一步分析）。同样，肿瘤也被切除、固定或冷冻。
TUNEL用于检测短期治疗组的卵泡凋亡情况。所有后续实验均在长期治疗组中进行。使用肿瘤体积指数评估肿瘤生长情况。肿瘤体积指数表示与肿瘤细胞注射 3 周后（治疗开始时）设定为 100% 的体积相比的相对体积。肿瘤细胞增殖通过 Ki-67 免疫染色法进行评估。肿瘤中 mTOR 通路的激活情况通过肿瘤蛋白提取物进行评估，并通过免疫印迹法进行分析。卵巢HE染色用于对原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、前卵泡和闭锁卵泡进行差异卵泡计数。卵巢中 mTOR 通路的激活情况是通过整个卵巢的蛋白质提取物和Western Blot分析来评估的。通过抗磷酸-S6激酶（mTOR通路的下游）免疫组化，评估卵巢内mTOR通路激活的定位情况。
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研究结果
环磷酰胺用药 24 小时后切除短期治疗组的卵巢，并对凋亡细胞进行 TUNEL 染色。对照组、Cy 组和 Cy + Rap 组均未检测到 TUNEL 阳性的原始卵泡。相反，在 Cy 组中，生长卵泡的许多颗粒细胞呈 TUNEL 阳性，而在对照组和 Cy + Rap 组中则呈阴性。随后的所有实验结果均来自长期治疗组。在整个治疗期间，Cy 组和 Cy + Rap 组的肿瘤体积指数平均稳定在 160-200% 和 130%。相比之下，药物对照组的肿瘤持续增长，平均肿瘤体积指数为 600%，明显高于两个治疗组。根据肿瘤的免疫印迹分析，与对照组和 Cy 组相比，药物对照组的 mTOR 通路被激活，而 Cy + Rap 组的 mTOR 通路被下调。肿瘤的 Ki-67 免疫染色显示，与对照组和 Cy 组相比，Cy + Rap 组显著抑制了细胞增殖。卵泡计数显示，Cy 组的原始卵泡数量明显少于对照组（P < 0.001），而 Cy + Rap 组的原始卵泡数量明显高于 Cy 组（P < 0.001，2.5 倍）。Cy组初级卵泡与原始卵泡的比例是对照组的两倍，但对照组与Cy + Rap组之间没有明显差异。卵巢的 Western 印迹分析显示，环磷酰胺激活了 mTOR 通路，雷帕霉素抑制了该通路。Cy 组的磷酸化-S6 激酶（pS6K）阳性原始卵泡率是对照组的 2.7 倍。然而，在 Cy + 雷帕组中，这种效应被抑制到与对照组相似的水平。
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研究结论
在异种移植乳腺癌小鼠模型中，雷帕霉素和环磷酰胺的周期性治疗方案作为单药具有足够的抗肿瘤作用，而雷帕霉素和环磷酰胺的周期性治疗方案通过抑制原始卵泡的活化，抑制了环磷酰胺诱导的原始卵泡丢失，这表明雷帕霉素和环磷酰胺可能对肿瘤增殖具有相加抑制作用。
参考文献:
Tanaka Y, Amano T, Nakamura A, et al. Rapamycin prevents cyclophosphamide-induced ovarian follicular loss and potentially inhibits tumour proliferation in a breast cancer xenograft mouse model. Hum Reprod. 2024 May 11:deae085.
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