抗体偶联药物（ADC）由单克隆抗体（mAbs）和细胞毒性剂（Cytotoxin，即有效载荷）通过化学连接物（Linker）共价结合而成，其结构通常如图 1所示。在ADC的研发过程中，优先选择人源化或全人单克隆抗体（hmAbs）作为药物递送载体，因为它们具有高度的细胞靶点特异性、较长的循环半衰期以及较低的免疫原性。
单克隆抗体因其对肿瘤特异性抗原的高亲和力而成为有效的载体，可以将杀伤性有效载荷定向传递至肿瘤细胞。此外，由于某些特异性抗原在人类肿瘤细胞中过度表达，一些单克隆抗体能够识别并结合这些抗原，触发对目标癌细胞的免疫反应，因此它们也可以作为单一治疗药物用于癌症治疗。
尽管如此，单克隆抗体在诱导细胞死亡方面的效力存在差异，这限制了它们的治疗效果，有时甚至可能完全无效。为了解决这一问题，通过将放射性同位素或细胞毒性药物（有效载荷）与单克隆抗体结合，可以显著提高治疗效果，克服单纯抗体治疗的局限性。
在开发抗体药物偶联物（ADC）之前，深入理解其各组分在体内的功能机制至关重要（如图1）。理想的ADC应保持单克隆抗体（mAbs）的特异性和靶向性，并能有效地释放有效载荷（Payload），以破坏肿瘤细胞。通常，通过静脉注射可以避免胃酸和蛋白水解酶对ADC中mAb的降解，因此静脉注射是更适合ADC药物递送的途径。此外，ADC中的mAb在血液中的循环时间更长，这有助于增强其与肿瘤细胞中特异性抗原的结合。
ADC进入血液后，mAb部分能够特异性地识别并结合肿瘤细胞表面高度表达的抗原，形成ADC-抗原复合物。随后，这些复合物通过受体介导的内吞作用进入细胞内，其中网格蛋白介导的内吞过程起着关键作用，形成初级内体。内体酸化后，有助于加速ADC中mAb与人类新生儿Fc受体（FcRns）的相互作用，这一过程通过缓冲机制防止ADC错误地递送到正常健康细胞。
内体的形成主要由FcRn控制，未结合的FcRn受体直接参与内体的形成，然后这些内体被运送至溶酶体进行降解。结合ADC的内体在溶酶体内被处理，释放出具有生物活性的细胞毒性Payload，这些Payload通常为抗有丝分裂剂。释放的Payload通过多种机制导致细胞死亡，如破坏DNA链或微管、抑制拓扑异构酶或RNA聚合酶、切割目标蛋白或诱导凋亡。
因此，通常选择对癌细胞具有高效力而对正常细胞毒性较低的细胞毒性化学制剂作为Payload。ADC中的mAb与Payload通过Linker以化学共价键结合，虽然Linker体积小，但它在ADC中扮演着重要角色，确保ADC在循环系统中的稳定性和良好的药代动力学特性，并在肿瘤部位高效释放Payload。Linker本身也应具有一定的稳定性。
简而言之，ADC可以被视为一种精确的抗肿瘤细胞毒性药物递送系统。ADC在从血管运输至肿瘤组织的过程中会经历不同的条件，其在细胞或分子水平上的作用模式较为复杂，每一步都面临挑战：
①血液循环：ADC在血浆中循环时必须保持裸抗体的特性，Linker在血液中必须稳定，以避免损害健康组织，并能通过高效分解或降解反应释放Payload，将Payload运送至目标部位。 ②抗原结合：偶联的mAb必须保持高免疫亲和力，连接细胞毒性化合物至mAb后不得影响其结合特异性。偶联位点应尽量避开mAb中与抗原结合的Fc或恒定区，以避免干扰mAb的抗原识别作用。 ③内化：必须达到足够的细胞内药物浓度，这通常较难，因为细胞表面的抗原靶点数量有限，导致抗原-抗体复合物的内化效率一般较低。 ④药物释放：一旦内化后，ADC必须在肿瘤细胞内有效释放Payload的活性形式。为了使Payload在释放后能够重新获得全部的细胞毒性能力，需要开发可在靶点位置释放完整无修饰形式的Payload的Linker。Linker可能会影响Payload结构的稳定性，因此必须在血浆稳定性和在靶细胞中高效释放药物的能力之间找到平衡。 ⑤细胞毒性作用：即使是在低浓度下，释放后的Payload的效力也必须足以杀死肿瘤细胞。为了获得足够的细胞毒性，必须使用IC50为亚纳摩尔级别的非常有效的药物。在以细胞毒性物质作为独立的化疗剂进行试验时发现，ADC中Payload的候选物须为高毒性化合物，其细胞毒性为传统抗癌药物的100到1000倍。此外，由于“3”和“4”的原因，通常需要将几种药物结合起来，并适当优化Payload的用量，以实现所需疗效。然而，如果抗体上附着了太多的细胞毒性分子，可能会被机体识别为受损蛋白而被迅速清除。此外，采用多种药物可能会影响药代动力学，因此大多数情况下每个抗体会偶联2-4种药物以提供最佳的治疗窗口。
选择合适的靶向单克隆抗体（mAb）和有效载荷（Payload）对于针对特定病变细胞的ADC药物开发至关重要。同时，连接子（Linker）的设计和偶联策略也是关键的开发要素。连接子通过共价键将mAb和Payload结合在一起，其分子结构和性质对ADC的药代动力学、药效动力学以及治疗窗口的宽度起着决定性作用。理想的ADC应达到以下标准：①连接子在血浆中应具有足够的稳定性，确保ADC能够在循环系统中正常运输，避免过早解离，从而将Payload精准地限制在肿瘤部位。如果Payload过早释放，可能会损害非靶细胞，引起不良反应。因此，需要根据抗原、肿瘤类型和Payload的特性选择合适的连接子，并进行优化以增强其稳定性。②一旦ADC到达目标肿瘤细胞，连接子应能够迅速释放未修饰的完整Payload。③在选择连接子时，还需考虑其疏水性。疏水性连接子与疏水性Payload的结合往往有助于ADC复合物在肿瘤部位的积累。
根据上述标准，已经开发出多种连接子和偶联技术。其中，最常用的两种偶联技术为化学偶联法和酶偶联法。根据Payload的释放机制，连接子结构可分为两大类：可裂解连接子（Cleavable linker）和非可裂解连接子（Non-cleavable linker）(见图2)。这些技术的选择和应用对于ADC药物的成功开发至关重要。
化学偶联：在化学偶联技术中，通过精确控制的化学反应，将单克隆抗体（mAb）表面的可用氨基酸残基与连接子（Linker）上的反应基团相连接。这一过程通常需要根据所采用的偶联策略，对抗体与有效载荷（Payload）的比例（Drug antibody ratios，DARs）以及结合位点进行优化，以确保偶联过程的效率和ADC药物的性能。
赖氨酸-酰胺偶联方法：赖氨酸-酰胺偶联方法是一种高效的ADC药物偶联技术，它通过含有羧酸酯基团的连接子（Linker）将有效载荷（Payload）与单克隆抗体（mAb）中的自由赖氨酸残基相连接。一个典型的mAb分子大约含有80个赖氨酸残基，其中大约10个可以参与化学偶联反应。这种偶联方式通常会导致产生多种具有不同药物抗体比（DAR）和偶联位点的ADC分子。然而，DAR对ADC的药代动力学/药效学（PK/PD）特性和细胞毒性有显著影响。有些赖氨酸残基在偶联后可能会干扰抗原-抗体相互作用。此外，尽管美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了一些基于赖氨酸的ADC药物，但这些通过赖氨酸-酰胺偶联策略得到的ADC往往具有较低的结合亲和力。因此，在实施赖氨酸-酰胺偶联时，需要精确控制DAR并优化偶联方法，以确保开发出满足特定需求的ADC分子。这包括选择最佳的DAR值和偶联位点，以平衡ADC的稳定性、靶向性和有效性。
半胱氨酸偶联方法：半胱氨酸偶联技术是一种将有效载荷（Payload）与单克隆抗体（mAb）结合的方法，它依赖于mAb中的半胱氨酸残基与Payload引入的硫醇反应性官能团之间的化学反应。在mAb中，所有的半胱氨酸残基通常都参与形成二硫键，没有自由的巯基。以IgG1为例，它含有4个链间和12个链内二硫键，但通常只有4个链间二硫键可以在特定条件下被选择性还原，从而提供有限数量的巯基用于偶联。由于巯基的数量有限，这种偶联方式的位点较少，反应过程相对明确。与赖氨酸-酰胺偶联策略相比，半胱氨酸偶联策略在控制ADC的异质性和药物抗体比（DAR）方面更为优越，能够产生更高效且具有更宽治疗窗口的ADC。此外，通过将活性钯膦络合物与芳基卤化物混合制备的芳基钯试剂，可以快速且有选择性地与抗体的还原半胱氨酸残基发生巯基芳基化反应，有效控制DAR。这种方法得到的芳基半胱氨酸偶联物具有更高的稳定性，对外部添加的硫醇、氧化剂、碱和酸的敏感性也更低。
酶法偶联：与化学偶联技术相似，酶促偶联方法也广泛应用于将细胞毒性有效载荷（Payload）与单克隆抗体（mAb）结合。这种方法可以有选择性地修饰抗体中的特定氨基酸序列及其功能基团。通过酶促偶联，可以实现在特定位点的精确偶联，从而更有效地管理和控制药物抗体比（DAR）。
转肽酶偶联法：转肽酶/分选酶（Sortase）是一种从金黄色葡萄球菌中提取的酶，它在转肽反应中用作偶联剂。Sortase具有识别蛋白质中的LPXTG序列（其中X代表任何氨基酸）的能力，并特异性地切割苏氨酸（T）和甘氨酸（G）之间的连接，形成酰基酶-底物复合物。随后，带有多聚甘氨酸的亲核基团攻击这个复合物，最终形成稳定的偶联产物。使用Sortase酶的方法允许通过化学计量学控制，精确地确定偶联位点和药物抗体比（DAR），同时不会干扰抗体与其相应抗原的结合能力。这种方法提供了一种精确控制ADC药物中有效载荷附着位置和数量的手段，有助于优化药物的性能和疗效。
微生物转谷氨酰胺酶偶联法：微生物转谷氨酰胺酶（Microbial transglutaminase，MTGase）能够催化一种特殊的转肽反应，主要作用于蛋白质或多肽中的谷氨酰胺残基，促进其酰胺基团与其他一级胺之间的酰基转移，从而参与蛋白质间或蛋白质与小分子间的交联，形成异肽键。利用这一特性，MTGase可以促使有效载荷（Payload）与去糖基化的单克隆抗体（脱糖mAb）中的特定谷氨酰胺残基（如Q295）发生共价结合，进而构建抗体药物偶联物（ADC）。这种方法为ADC的制备提供了一种通过特定氨基酸残基进行定点偶联的策略。
基于氮葡聚糖工程技术的偶联法：通过应用基于β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2,6-唾液酸转移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技术开发了一种偶联技术。在体外条件下，可以利用这些转移酶的催化反应在蛋白质的糖链末端引入唾液酸。随后，这些唾液酸残基可以通过高碘酸盐氧化生成醛基，进而与有效载荷（Payload）形成肟键，实现共价偶联。这种技术的一个显著优势是其高度的可重复性，不受N-Glycan异质性的影响，因此适用于任何含有不同N-Glycan结构的单克隆抗体（mAb）与Payload的偶联过程。这为ADC的制备提供了一种灵活且可靠的偶联策略。
连接子（Linker）在抗体药物偶联物（ADC）的结构中扮演着核心角色，它对ADC的药代动力学特性、治疗窗口和药效学表现有着显著影响。Linker的设计确保了ADC在血液循环中的稳定性，并有助于减少非靶向细胞的副作用。同时，在ADC被肿瘤细胞内化后，Linker需要能够迅速释放细胞毒性药物，以发挥治疗效果。此外，药物抗体比（DAR）是ADC开发中的一个关键参数，它直接关系到药效、稳定性和药代动力学特性。因此，优化抗体上的结合位点对于解决这些问题至关重要。在常见的ADC中，DAR值通常接近4。Linker可以根据其是否能够在特定条件下裂解，被分为两大类：可裂解连接子（Cleavable linker）和非可裂解连接子（Non-cleavable linker）。可裂解连接子设计成在肿瘤细胞的特定环境（如酸性环境或酶的作用下）中能够裂解，从而释放Payload；而非可裂解连接子则在细胞内保持稳定，直接将Payload传递到细胞内部。
可裂解Linker：可裂解连接子（Cleavable linker）可以根据其在肿瘤细胞内环境的反应特性进一步细分为三种类型：腙类、二硫化物类和肽类连接子。这些连接子在肿瘤细胞特有的细胞内环境中展现出不同的敏感性，分别是对低pH值的敏感性、对谷胱甘肽的敏感性以及对蛋白酶的敏感性。①酸敏感性腙类连接子：这类连接子在癌细胞的内体和溶酶体中的低pH环境（pH值约为4-6）下容易发生酸性水解，这有助于有效载荷（Payload）的释放。②谷胱甘肽敏感性二硫键连接子：这类连接子在血液循环中保持稳定，但能在癌细胞内较高浓度的谷胱甘肽作用下发生释放。癌细胞中的谷胱甘肽浓度较高，这与其生长和缺氧状态下的高度应激反应有关。③蛋白酶敏感性肽类连接子：这类连接子能够被肿瘤细胞内特定的蛋白酶识别并切割。例如，组织蛋白酶B能够切割ADC中的二肽键，这是一种肿瘤特异性蛋白酶；缬氨酸瓜氨酸是一种对组织蛋白酶B敏感的二肽；β-葡萄糖醛酸酶在许多肿瘤中过量表达，β-葡萄糖醛酸对这种酶较为敏感，可以被其降解，因此可以作为蛋白酶敏感的连接子，用于选择性地释放有效载荷。
非可裂解Linker：非可裂解连接子（Non-cleavable linker）通常由不可降解的硫醚或马来酰亚胺己酰基（Maleimidocaproyl，MC）等组成，它们在抗体药物偶联物（ADC）中确保有效载荷（Payload）在被靶癌细胞内化后，能够通过溶酶体酶的作用而降解。例如，Kadcyla是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ADC药物，它通过不可降解的MC连接子将maytansinoid毒素与单克隆抗体（mAb）相连接。连接子和偶联技术正在不断进步，新的高效连接子不断被开发出来。例如，Syntarga是一种由SpaceLink Technology和Syntagra BV开发的高灵活性的基于连接子的ADC，其连接子与有效载荷之间的结合是可逆的。通过合理选择和优化连接子及其与有效载荷的偶联策略，可以显著提高ADC的治疗效果，并减少对非靶细胞的影响。这种优化有助于实现更精准的靶向治疗，提高药物的疗效和安全性。
抗原的选择：在抗体药物偶联物（ADC）的开发中，选择合适的靶抗原是实现治疗成功的关键。理想的靶抗原应满足以下条件：①特异性：靶抗原应仅在肿瘤细胞中表达，而不出现在正常健康组织细胞中。②内化能力：在配体结合后，抗原应能够通过内吞作用被细胞内化，并能够从细胞内部循环回到细胞膜上。③表达均匀性：在肿瘤微环境中，抗原的表达应该是均匀的，而在血液循环系统中的可及性应该较低。
综上，ADC需要具备高度的靶向特异性，并且尽量减少副作用。它们应该只在癌细胞中表达，避免在正常健康细胞中引起反应。特别是在实体瘤的治疗中，肿瘤的体积较大且存在异质性，这增加了治疗的复杂性。为了应对这一挑战，需要对抗原进行优化，以增强肿瘤细胞对特定靶点的内化效率。内化效率通常受靶细胞类型、抗体特性和抗原表位特征的影响。
尽管大多数抗原主要分布在细胞外表面，且只有少数抗原会被内化，但抗原的内化并非治疗效应产生的必要条件。例如，通过二硫键连接的ADC可以在实体肿瘤部位的内皮下细胞外基质中被还原，这有助于增加肿瘤血管附近有效载荷（Payload）的积累，从而促进药物向肿瘤组织内部的扩散。此外，靶向肿瘤抗原的另一个挑战是物理和动力学障碍，这包括与抗原异质性表达和肿瘤间质高压相关的旁侧效应。这种效应可能导致Payload从肿瘤细胞内部扩散到邻近的健康细胞，从而可能对它们产生不良影响。因此，ADC的设计需要考虑到这些因素，以确保药物的有效性和安全性。
抗体的选择：在抗体药物偶联物（ADC）的研发过程中，选择合适的抗体是至关重要的一环。理想的抗体应满足以下五个关键特性：①高抗原亲和力：抗体应具有高亲和力，以便能够紧密地与靶抗原结合。②靶向特异性：抗体应具有高度的靶向特异性，确保仅与肿瘤细胞上的特定抗原结合。③长循环时间：抗体在体内的循环时间应足够长，以提高其与肿瘤细胞接触的机会。④低免疫原性：抗体应尽可能减少引起免疫反应的可能性，以避免患者的免疫排斥。⑤无免疫交叉反应：抗体应避免与其他非靶点组织发生交叉反应，以减少副作用。
理想的抗体通常具有0.1-1纳摩尔（nM）范围内的结合亲和力。在早期的ADC研究中，通常使用小鼠抗体，但这些抗体常引起强烈的免疫原性反应。为了解决这一问题，科学家们通过生物工程技术开发了嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体等。目前，ADC的研发主要采用人源化或全人源抗体。在人源化抗体的开发中，可以通过将小鼠的互补决定区（CDR）重新表面化，或者直接将其移植到人类抗体的可变区（Fv）表面来实现。在临床试验中，大多数ADC由人类免疫球蛋白G（IgG）构成，尤其是IgG1亚型，因为它们具有较长的半衰期和有效的效应功能。
抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体（mAb）、连接子（Linker）和有效载荷（Payload）组成，其分子特性复杂，因此需要运用多种分析技术来详细描述其特性。以下是一些常用的分析方法：
分离技术：用于表征ADC的纯度、药物载量和单体含量。
尺寸排阻色谱法（SEC）：用于分离基于分子大小的ADC。 反相色谱法（RPC）：用于分析ADC的疏水性相互作用。 疏水相互作用色谱法（HIC）：用于基于疏水性的分子分离。
电喷雾电离质谱（ESI-MS）：用于观察分子离子或准分子离子，以识别特定偶联技术的ADC的药物分布。
液质联用（LC-MS）：与RPC结合使用，以确定ADC的偶联类型和DAR。
这些分析方法为ADC的开发提供了全面的质量控制和特性分析，确保药物的安全性、有效性和一致性。通过这些技术，研究人员能够精确地评估ADC的纯度、稳定性、药物分布和生物学活性，从而优化ADC的设计和生产过程。
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