大肠杆菌高密度发酵工艺介绍

随着分子生物学技术的迅速发展, 许多有重要应用价值却又难以直接合成的蛋白质已经在多种表达系统中得到表达。在众多的基因工程表达系统中, 大肠杆菌结构简单、遗传学背景清晰、容易培养、生长周期短, 目前已成为最为常用的原核表达系统, 许多有价值的重组蛋白都在大肠杆菌中获得了表达。近年来, 随着大肠杆菌基因重组技术与大肠杆菌高密度发酵技术的结合, 使得原来无法获得的许多天然蛋白能够大量生产。高密度细胞培养技术(high cell density cultivation, HCDC), 也称高密度发酵技术, 是指在一定培养体系下, 通过改进培养方式和培养条件, 显著提高菌体发酵密度,最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的细菌培养技术。重组大肠杆菌细胞高密度培养是获得高外源性蛋白产率的一种重要策略, 该技术不仅可以减少培养体积, 强化下游分离提取, 还可以缩短生产周期、减少设备投资, 从而达到降低生产成本, 提高生产效率的目的。

本文就影响重组大肠杆菌高表达高密度发酵的主要因素行阐述, 包括宿主菌类型、培养基组成、诱导剂的选择、培养条件的选择、补料方法的选择、抑制性代谢产物的影响等。

一、宿主菌类型

不同的大肠杆菌菌株在生长条件、外源基因表达能力、代谢副产物的产生情况, 以及对抑制性代谢副产物的耐受能力等方面都存在着很大的差异。因此, 宿主菌是决定基因工程产品能否工业化生产的关键因素。在菌株的改良方面科研人员展开了深入的研究。由于乙酸是大肠杆菌高密度培养过程中主要的抑制性代谢副产物,科学家采用Co诱变结合连续培养DH5α, 得到了耐乙酸突变菌株DA19 。DA19 与DH5α相比, 在复合培养基YPS2G中菌体浓度提高5%, 最大比生长率提高27%, 乙酸生成量减少59 %。DA19的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性高于DH5a, 而磷酸果糖激酶和乙酸激酶活性则低于DH5a , 据此可以推测是由于代谢途径关键酶的活性不同, 导致了二者代谢的差异。

二、培养基组成

根据组成成分, 培养基可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基。目前大肠杆菌高密度发酵所使用的培养基一般为半合成培养基, 它是在合成培养基的基础上添加能促进细胞生长、代谢或形成产物的培养基质, 如适量的碳、氮、无机盐、氨基酸、维生素等。在大肠杆菌高密度发酵中, 通常需要投入几倍于生物量的培养基质, 以充分满足大肠杆菌高密度生长的需要。而单纯靠增加培养基质并不能实现高密度发酵, 培养基各营养物质的浓度要适当, 过量的营养物质还会抑制菌体的生长。

①碳源：大肠杆菌高密度高表达发酵控制中优化碳源是关键因素。常用的碳源有糖类、低碳醇、油脂和有机酸等。由于大肠杆菌利用葡萄糖生长速度快, 并且测定方便, 葡萄糖是目前大肠杆菌发酵中最常用的碳源物质。但葡萄糖添加过量时容易使大肠杆菌生长速率过大, 导致葡萄糖效应, 产生乙酸等代谢副产物, 不仅影响菌体的生长, 而且不利于外源蛋白的表达。因此, 采用葡萄糖为碳源发酵时, 需要严格控制葡萄糖的浓度和菌体生长速度。为了找到更适合大肠杆菌生长的碳源, 人们对其他产酸较慢、产酸较少的碳源(如甘油、乳糖、甘露糖)展开了研究。在高密度发酵工程菌YK537pSB-TK时发现, 利用甘油作为碳源发酵时, 有机酸产生少, 培养15h乙酸含量仅为16.4g/L远低于利用葡萄糖发酵时的乙酸含量(24.6g/L), 而且菌体最终密度也较高。由此可见, 以甘油代替葡萄糖作为碳源可以有效减少抑制性代谢产物乙酸的积累, 更有利于重组菌的高密度发酵。

②无机盐：微生物要维持正常的生长代谢, 除需要碳源和氮源外还需要Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺ 、Na⁺等必需离子, 这些离子参与细胞的基础代谢, 调节酶系活性并维持细胞膜内外渗透压平衡。根据大肠杆菌在基本培养基中的生长量推导出获得1g/L的大肠杆菌所需的各种无机盐的量(以1L培养基的量计算)为:0.77g NH4Cl , 0.125g KH2P04, 17.5mg MgSO4·7H2O,7.5mg K2SO4·7H2O, 0.64mg FeSO4·7H2O , 0.4 mg CaCl2 。在高密度发酵重组肿瘤坏死因子大肠杆菌时发现,基质中磷酸盐含量显著影响工程菌的最终密度，磷酸根浓度在0.15M时对菌体密度和重组蛋白表达量最为有利;当磷酸盐的浓度过低时, 不能满足菌体生长需要, 菌体密度较低;当浓度过高时, 早期细菌生长过于旺盛, 导致菌体较早衰老, 菌体密度仍不能达到很高。在研究镁离子对重组大肠杆菌表达羧肽酶原B的影响时发现, 添加1 g/L镁离子能明显促进菌体的生长和提高重组蛋白的表达, OD600值由52提高到83 , 包涵体由9g/L提高到17.4g/L ;进一步的实验发现, 添加1g/L镁离子能明显抑制菌体自溶解, 活细胞密度从137×10⁶个/ mL 提高到376 ×10⁶个/ mL, 质粒的稳定性也明显提高, 质粒丢失率从15.4%下降到1.1%, 外源蛋白的稳定性也大大提高。

③微量元素：微生物对Fe²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺等微量元素需求量很少, 但微量元素对微生物的生长起很大的作用。其中亚铁离子对微生物的生理有显著的影响。在研究微量元素对大肠杆菌生长和乙酸生成的影响时发现, 在培养基中添加Fe²⁺可以促进多种大肠杆菌菌株的生长, 降低乙酸的生成量, 推测当培养基中Fe²⁺供应不足时, 引起呼吸链中许多含铁的组分(如琥珀酸脱氢酶、细胞色素还原酶等)活性下降, 导致呼吸量的电子传递通量降低。由于NADH不能被有效氧化, 造成ATP供应不足, 大肠杆菌就会通过乙酸生成途径产生ATP供菌体所需, 最终导致大肠杆菌产生大量的乙酸。

诱导剂的选择

目前最常用于诱导大肠杆菌表达异源蛋白的诱导剂是异丙基-β-D硫代半乳糖(ITPG)。尽管IPTG的诱导效果令人满意, 但是IPTG的缺点限制了它在大规模发酵生产中的应用。一方面IPTG价格十分昂贵, 尤其在大批量生产重组蛋白时, IPTG的大量应用会造成生产成本的增加;另一方面IPTG对人体具有毒性, 会对发酵所得的生物产品带来不利影响。为了寻找ITPG的替代物, 国内外学者做了大量的尝试。研究表明, 可以用乳糖取代IPTG诱导乳糖启动子进行诱导表达。在诱导重组大肠杆菌BL21表达三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD时发现, 用乳糖诱导时, 目的蛋白表达量占总蛋白量的36.62%, 与IPTG的诱导结果(35.03%)无明显差别, 而且收获的菌体量比用IPTG 诱导时更高。在诱导重组大肠杆菌表达B淋巴细胞刺激因子时，综合比较了乳糖和IPTG的效果, 发现用乳糖作为诱导剂时, 目的产物占总蛋白量的15.7 %, 略低于IPTG的诱导效果, 但成本仅为用IPTG诱导时的3%。尽管乳糖的诱导效果也不及IPTG, 诱导过程也比IPTG复杂的多, 但乳糖所具备的无毒与价廉的优点, 对工业化发酵生产重组蛋白具有重要的意义。

三、培养条件的选择

①溶解氧：大肠杆菌的各个生长过程均需要氧气的参与, 溶解氧浓度对菌体的生长和产物的形成影响很大。尤其在高密度发酵中期, 菌体呈指数扩增, 耗氧量极大, 如果供氧不足会导致大量乙酸生成, 蛋白合成受到抑制, 菌体生长速率下降,甚至发生自溶。为此, 人们开发出了许多提高溶解氧供应的方法, 如提高发酵罐的罐压、通入纯氧, 在培养基中添加H2O2 , 在大肠杆菌工程菌中同时表达血红蛋白等。在探索溶氧对L-天冬酰胺酶发酵过程的影响时, 发现在发酵培养基中添加氧载体5 %正十二烷, 可以显著提高发酵介质中的溶氧水平, 改善供氧条件, 提高L-天冬酰胺酶发酵水平;在此基础上,通过采用通纯氧自控pH的发酵工艺,进一步提高了溶氧水平, 最终L-天冬酰胺酶的表达水平较分批发酵提高了83% 。然而,在培养重组杀菌肽-X大肠杆菌时发现溶氧并不是越高越好, 过高的溶氧对重组蛋白的表达有着潜在的抑制作用, 其研究发现在高溶氧(溶氧20%～40%)条件下, 工程菌生长迅速, 但目的融合蛋白的表达量极低, 而在限氧状态下最适于工程菌的表达, 包涵体的得率最高。所以在实际中, 常常将溶氧水平控制在临界值以上一定的范围内, 可避免菌体因供氧不足或过量带来的伤害。

②pH值：发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标, 是一项重要的发酵参数。在培养过程中保持pH的相对稳定有利于大肠杆菌的生长和重组蛋白的合成。在分批培养重组大肠杆菌时用酸碱对发酵液的pH进行了控制, 保持发酵液的pH稳定, 发现细胞的生长和产物的形成均优于不调节pH的分批培养过程。近期又有报道称在发酵过程中, pH对菌体的生长以及重组蛋白的表达影响显著, 而且同种微生物的最适生长pH值和最适产物积累pH值往往不一致, 在不同的培养阶段采用不同的pH值可以大大提高产量及产率。在利用30L发酵罐对重组大肠杆菌发酵生产H LCⅡ中发现, 细菌的生长和HLCⅡ的表达具有不同的最适pH值, 进而采用pH两阶段控制策略培养工程菌, 最终得到的蛋白量较恒定pH条件下提高了7.61 %, 达到11.3g/L。

③温度：温度会影响各种酶的活性, 是影响工程菌生长代谢、重组产物形成和质粒稳定性的重要因素。对于大肠杆菌化学表达系统, 一般认为在较高的温度下进行诱导, 因为较高的温度有利于细菌的生长, 可以获得较高的生物量。但近期有学者发现在较低温度下进行诱导更有利于重组蛋白的表达, 因而对发酵结果更为有利。在对重组大肠杆菌的诱导温度进行优化时, 比较了分别在37℃、34℃、30℃和27℃下进行诱导的效果, 发现较低温度时蛋白表达率和活性有很大程度的改善, 30℃诱导时产物的活性最高, 每毫升发酵液的酶活力为4757U , 约为37℃诱导时的2.7倍。较高的温度有利于细菌的快速生长, 低温培养能提高重组产物的表达量, 在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量。对于大肠杆菌温度表达系统, 温度的选择和变化对外源基因的表达更为重要。传统的温度诱导方式是持续高温诱导。采用传统的方式诱导时, 细菌在高温下会维持较高的比生长速率, 进而引起代谢副产物乙酸的积累, 从而抑制目的蛋白的表达。传统的持续高温诱导方法会降低菌体的生理活性, 降低工程菌质粒的拷贝数, 影响目的蛋白的表达;而采用两次升温诱导(30℃→42℃→37℃→42℃)有利于恢复菌体活性, 增加菌体质粒拷贝数, 提高目的蛋白的表达量。

四、补料方法的选择

工业上对微生物的培养主要有分批培养、连续培养以及改进的分批补料培养等几种方式, 其中分批补料培养是获得高浓度生物量最有效的方法。葡萄糖因价廉易得, 容易利用且起效快, 已广泛用作重组度高密度发酵的补料基质。但大肠杆菌在过量葡萄糖的条件下会发生“葡萄糖效应” , 积累大量乙酸, 影响重组菌的生长和外源蛋白的表达。因此合理添加碳源使葡萄糖效应降到最低, 是大肠杆菌高密度发酵成功的关键。根据需要不同, 国内外学者已建立了多种补料方法,按流加方式的不同, 可分为非反馈补料法和反馈补料法。

①非反馈补料法：非反馈补料法是目前常用的补料方法,按流加速度的不同, 可分为恒速流加补料法、变速流加补料法和指数流加补料法。其中指数流加补料法是一种较为成熟的补料方法。指数流加补料法是根据在指数生长期内菌体数目呈指数增加, 可以同时指数流加营养物质, 保证菌体以恒定的比生长速率生长的一种补料方法。对重组大肠杆菌进行了指数流加培养, 培养25h后细胞干重与重组谷胱甘肽蛋白总量分别达到80g/L和880mg/L, 比摇瓶结果分别提高8.3和4.6倍。指数流加可以使基质浓度保持在较低水平, 有效地抑制副产物的积累, 提高外源蛋白的表达效率。同时有研究者发现, 采用指数流加补料法可获得较高的细胞得率, 但外源蛋白产量并不会明显提高。这可能是由于指数流加补料法是根据微生物指数生长理论而发展起来的方法, 所以其对微生物生长的促进作用要大于对外源蛋白表达的促进作用。

②反馈补料法：由于非反馈补料法的补料程序都是预先设定的, 如果微生物的生长方式与预想不一致时, 非反馈补料法不能对其进行有效的调节, 容易使营养物质积累导致乙酸的生成。近期有学者尝试采用反馈补料法来解决这一问题。反馈补料法是指依据菌体代谢时会产生某种特殊物质(如乙酸, 二氧化碳等)使发酵中一些参数发生变化, 可以根据参数的变化, 判断菌体代谢状况进行补料。由于反馈补料法能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略, 从而能够很好地控制系统的营养浓度, 防止营养浓度过高, 故被广泛应用于工程菌的高密度培养。根据反馈指标的不同, 反馈补料法又可分为恒pH值补料法、恒溶解氧补料法、平衡DO-stat法等。1).恒pH值补料法，当营养充足时, 菌体利用营养物质产酸和CO2 , 导致培养液pH下降;当营养不足时菌体利用大量氮源产生碱性物质, 导致pH值上升。因而可以把pH值的变化作为需要补料的标志, 通过补充合适的补料培养基, 维持培养液pH值在一个合适的值, 进行恒pH补料。在高密度发酵重组海藻糖合成酶工程菌时, 采用恒pH值法反馈流加氨水和葡萄糖, 保持培养液的pH值为6.8 , 将乙酸积累控制在6.26g/L以下, 补料发酵12h后, 获得细胞干重为51.5g/L, 是分批培养的7.5倍, 蛋白表达率为15.2 %是分批培养的4.5倍。但有学者指出由于pH变化不完全是葡萄糖代谢的结果, 该方法容易造成补料体系的错误。2).恒溶解氧补料法当营养充足时, 菌体会大量利用营养物质生长代谢, 同时消耗大量的氧, 导致溶解氧下降;当营养物质不足时, 菌体代谢强度下降, 耗氧量也减少, 导致溶氧上升。所以可以把溶解氧的变化作为控制补料的指标, 通过补充合适的补料培养基, 维持培养液溶解氧值在一个合适的值,进行恒溶氧补料。采用恒溶解氧法发酵工程菌DH5α/ pBV-LTLTNF时, 保持培养过程中的溶解氧为30 %～40%, 同时限制性流加葡萄糖, 发酵12h后, 菌体OD600到达40～50, LTLTNF产量达菌体总蛋白的50% , 达到5.12g/L 。利用恒溶解氧补料法时发现, 由于在培养初期菌体密度低, 溶氧变化不明显, 使用该方法补料易导致补料滞后。

五、抑制性代谢产物的影响

大肠杆菌在发酵过程中会产生有机酸和二氧化碳等有害代谢产物。其中乙酸是大肠杆菌的主要副产物, 对菌体生长的影响尤为严重。较高浓度的乙酸(>5g/L)就能对细菌比生长速率产生负面影响, 最终生物产量及重组蛋白表达量都产生可观测到的抑制作用。当发酵液中的溶氧不足或大肠杆菌的比生长速率过大时, 菌体便容易形成乙酸。另外当碳源的加入量超过大肠杆菌的同化速度, 大肠杆菌也会发生Crabtree效应而产生乙酸。关于产生乙酸的机制,有研究人员认为乙酸的产生与细胞中电子传递和氧化磷酸化、三羧酸循环有关:细菌在低比生长速率时通过氧化代谢产生的能量足以满足合成和异化作用的需求,不会产生乙酸, 而在比生长速率过高时, 大肠杆菌不能通过三羧酸循产生足够的能量, 还必须通过糖酵解途径提供ATP和NADH2, 并同时产生乙酸。关于乙酸的抑制作用机理, 目前还不是很清楚。有研究人员推测乙酸抑制机理为:乙酸在中性pH环境中以离子化(CHCOO^-)和质子化(CHCOOH)两种形式存在, 质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进人胞内, 在胞内(pH7.5)解离成CHCOO^-和H⁺, 这样就降低了膜内的pH值使膜内外的pH差减小, 减弱了质子推动力, 产生的能量就被大大减少了, 扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。

重组大肠杆菌的高密度发酵技术在生产实践中得到了广泛应用, 并且取得了令人惊喜的成果。但是在该技术实际应用中还存在许多需要解决的问题, 其中最为严重的就是培养过程中菌体过早地衰老和外源基因表达率低。这主要是由于某些关键变量的在线检测仪器设备的缺乏, 导致了很多的调控手段实际应用的结果并不是很理想。近年来, 随着发酵设备的改进, 一些检测设备不断出现, 人们能更加详细的了解环境变化和细胞生长代谢过程, 为高密度发酵的调控手段提供了很好的依据。比如, 随着葡萄糖电极技术的逐渐成熟, 人们可以根据培养液中的关键物质--葡萄糖的浓度进行补料,把培养基中的葡萄糖浓度维持在较低的水平, 从而有效地减少葡萄糖效应, 减少乙酸的生成。总之, 基因工程产品在化工、食品、环保、医药等方面有着极大的潜能, 而重组大肠杆菌高密度高表达发酵技术是基因工程产业化的关键问题。因此, 必须结合实践情况选择最佳的宿主菌, 培养基组成、培养条件、培养方式、补料方法, 并采用适当的方法减少发酵过程中抑制性代谢产物的积累, 最终实现高密度发酵。