细菌内毒素是热原的一种，来自革兰阴性菌的外膜。极微量的内毒素进入动物或人体内都会引发强烈的炎症反应，导致轻微如发热，重则死亡的严重后果。各国药监部门对生物产品中的内毒素含量均有严格规定。欧洲药典规定注射剂内毒素限度不得高于5 EU/（kg·h），EU为内毒素单位，每EU内毒素约相当于100pg。
细菌污染的风险在生物制药工艺中广泛存在。防止细菌污染，控制产品中内毒素含量是广大生物制药从业人员所面临的巨大挑战。生物药物中，单克隆抗体药物因为使用剂量大（几十到几百毫克），对内毒素限度的要求因而更高。单克隆抗体作为一类靶向药物，以其突出的疗效和较低的不良反应获得了医药界的极大重视，单抗药物的研发也异常活跃。单克隆抗体作为生物大分子药物，生产和纯化工艺复杂，有诸多环节可能将内毒素带入生产工艺之中。因此，纯化工艺步骤中有效去除内毒素的能力将为产品符合内毒素标准提供保障。
内毒素是脂多糖(LPS)，其结构包含3 个区域，即类脂A 区、核心多糖区和特异性多糖区。其中，核心区的磷酸化导致内毒素在一般蛋白溶液中带负电荷。内毒素的类脂部分为疏水区，使内毒素可以像一些双极性分子一样形成微球或微囊结构，将疏水区包裹在里面。内毒素单体的相对分子质量为10×103~20×103，其聚合形态的相对分子质量可超过1000×103。
因为内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大增加了去除的难度。在蛋白溶液中去除内毒素需要着重考虑所用方法对内毒素的特异选择性，即尽量减小蛋白的损失，又对内毒素有较高的亲和力。多聚赖氨酸即表现出对内毒素有亲和作用，以其作为配体的层析介质可以选择性结合内毒素。因为内毒素一旦在水溶液中聚集，分子大大增加，膜过滤/超滤法有望通过分子大小的不同将内毒素与蛋白分子分离。同样利用层析原理，精氨酸溶液冲洗已被证明可以将附着在固定相上的单抗分子内毒素去除。
1，填料法去除内毒素：内毒素去除填料是一款离子交换介质，由多聚赖氨酸共价连接在纤维素基质上制成。多聚赖氨酸在填料pH值范围内（pH6~8）带正电荷，可以与带负电荷的内毒素结合，并常用于去除内毒素的工艺中。研究发现，抗体溶液与内毒素去除填料混合孵育1 h后，用Spin柱收集流穿的蛋白样品，发现起始含量为0.8~8EU/mg单抗溶液中的内毒素均去除了70%，而单抗蛋白几乎没有损失，数据见下表：
2，纳滤法去除内毒素：如下表所示，在第一组实验中，含有250 EU/mL内毒素的蛋白溶液（蛋白浓度33.24 mg/mL）经纳滤过滤后，内毒素含量下降了89%，不弱于使用内毒素去除填料的效果。在过滤过程中，20 nm 滤器出现堵塞现象，跨膜压力差大幅增加，可能是内毒素在膜前蓄积造成膜的堵塞。这种现象在内毒素含量低的蛋白料液过滤中没有发生，因此判断不是由于单抗分子造成的。第二组实验在纳滤膜包的上游安装了配套的前滤器，其性质是一种带正电荷的深层滤器，可以拦截颗粒状物质，增加纳滤膜包的处理量。在加装了深层预过滤器的纳滤中，总体内毒素去除也达到88%，与没有预过滤器的情况一致，但料液处理量大幅增加，由每平方米纳滤膜41.6 g 蛋白提高到874.8 g，达21倍。
3，氨基酸清洗法：将单抗结合在蛋白A柱上后，可以通过精氨酸溶液冲洗，去除混杂在抗体中的内毒素。精氨酸冲洗去除内毒素的机理尚不清楚，但其残基带正电，可能利用电荷作用将内毒素与带正电荷蛋白质分开，达到去除的效果。
精氨酸清洗：单抗按照上样至蛋白A柱上后，用10个柱体积的0~0.5 mol/L精氨酸溶液线性梯度冲洗层析柱，并接续使用6倍柱体积的0.5 mol/L精氨酸溶液冲洗，再用20倍柱体积的柱平衡液冲洗充分去除残留精氨酸之后，将单抗蛋白洗脱。结果显示，在0.5 mol/L 精氨酸线性梯度冲洗过程中，精氨酸在150mmol/L 水平即可洗脱大量内毒素（50~100 EU/mL）。此外，在后续梯度及6个柱体积的冲洗中一直持续并略有降低，说明精氨酸溶液冲洗掉内毒素的作用持续存在，最终内毒素的去除效率>97%。如果增大精氨酸溶液冲洗的体积，单抗洗脱液中的内毒素含量有可能进一步降低。
组氨酸清洗：与精氨酸溶液清洗相似，用10个柱体积的组氨酸溶液的0~0.3 mol/L线性梯度冲洗，随后进行10个柱体积的0.5 mol/L等度冲洗。结果显示，0.3 mol/L组氨酸溶液即已将大部分内毒素去除，需要注意的是0.5 mol/L组氨酸在pH7.4时发生盐析，因此在使用高浓度的组氨酸溶液时应对pH进行调整，如将0.5 mol/L组氨酸溶液pH值调节至6.5后在使用。与精氨酸相比，组氨酸相对较低的浓度和相对较小的冲洗体积可取得相似的内毒素去除效果，即最终内毒素的去除效率>97%。
