色谱柱作为色谱分析的关键部件，其性能和使用寿命与清洗和再生过程有着直接的联系。为了维持色谱柱的分离效率并延长其使用寿命，定期对其进行清洗是至关重要的。然而，清洗色谱柱并非一项简单的工作，需要根据污染物的特性来选择合适的溶剂和清洗方法。下文为各位同仁提供一份色谱柱清洗与再生指导，以帮助各位有效地保养色谱柱。
随着使用时间的增长，色谱柱可能会因为样品残留、缓冲盐、添加剂等因素的影响而导致性能下降，这通常表现为压力上升、色谱峰形出现异常（例如拖尾、肩峰、峰分岔）或分离效果降低。清洗色谱柱的主要目的是清除这些污染物，并将其妥善保存于适宜的溶剂中，以便再次使用。
为了达到最佳的清洗效果，必须根据污染物的特性来挑选合适的溶剂。以下是一些适用于反相色谱柱的常用清洗溶剂：
水：用于清除色谱柱中的盐分及其他水溶性物质。 甲醇、乙腈：作为常用的有机溶剂，适用于去除色谱柱上的有机物和疏水性污染物。 异丙醇：具有更强的洗脱能力，适合处理难以清除的污染物。清洗方案示例： 对于极性污染物，可以逐步使用水和甲醇等溶剂进行清洗。 对于非极性污染物，异丙醇和二氯甲烷等溶剂更为有效。 对于蛋白质类污染物，可以使用DMSO或盐酸胍溶液，并在提高温度的条件下促进污染物的溶解。
清洗时间并非固定不变，而是根据通过色谱柱的溶剂体积来确定。色谱柱的体积可以通过色谱柱的圆柱体积乘以填料孔隙率（通常约为0.6）来计算。例如，对于一根4.6×150mm的色谱柱，其柱体积大约为1.5mL。推荐的清洗溶剂使用量为：
常规清洗：至少使用10倍柱体积的溶剂，例如，对于上述色谱柱，需要通过15mL的溶剂，大约需要15分钟。 深度清洗：如果需要更彻底的清洗，建议使用20倍柱体积的溶剂，并持续约30分钟。在进行梯度洗脱时，系统的延迟体积和流动相的化学平衡性会影响重新平衡所需的时间。通常，延迟体积越大，所需的平衡时间也越长；使用缓冲盐时，平衡时间也需要相应增加。
根据使用情况的不同，清洗步骤可以分为“常规清洗”和“非常规清洗”。4.1 常规清洗步骤
在使用不含添加剂的流动相后，使用高比例的有机溶剂（如甲醇或乙腈）冲洗色谱柱，至少20倍柱体积，以确保常规污染物被清除。 在使用含盐或添加剂的流动相后，首先使用与流动相起始相同的无盐水相冲洗20倍柱体积，以去除盐分，然后使用高比例的有机溶剂再冲洗20倍柱体积。 色谱柱清洗后的保存：建议在清洗后将色谱柱保存在合适的有机溶剂中，短期保存可以使用甲醇或乙腈，长期保存则建议使用甲醇。4.2 非常规清洗步骤 当色谱柱效率下降但未受物理损伤时，可以通过长时间使用甲醇或乙腈进行冲洗，必要时可使用异丙醇。如果这些方法无效，可以按照说明书中的再生方案，尝试使用更强的溶剂。 如果色谱柱发生堵塞，可能是由于样品残留的缓冲盐、颗粒物或杂质造成的。这时可以使用高比例水相在高温下冲洗，或选择溶解性更强的有机溶剂。如果这些方法仍无法解决问题，可以考虑反冲洗，但需小心操作，因为反冲洗可能会对色谱柱造成损害。
增加流速可以缩短清洗时间，因为清洗效果主要取决于通过的溶剂体积。然而，在色谱柱堵塞的情况下，增加流速可能不是一个好主意，甚至可能加剧堵塞。因此，流速的调整应根据实际情况灵活处理。
使用在线过滤器和保护柱可以有效减少污染物进入色谱柱主柱。 定期清洗，特别是当处理复杂样品或含盐缓冲液时，及时清洗有助于防止污染物的积累。 当系统压力或柱效下降超过10%时，应及时更换在线过滤器和保护柱。
通过遵循上述清洗与再生步骤，可以有效地清除污染物，恢复色谱柱的性能，并延长其使用寿命。每次清洗都应根据实际情况灵活调整，以确保色谱柱始终处于最佳状态。
